高效液相法測定蜂蜜中甘油的含量

楊 娟

上海工微所科技有限公司， 上海 200233

蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，與自身分泌物混合后，經(jīng)充分釀造而成的天然甜物質(zhì)[1]。常溫下蜂蜜呈半透明、粘稠流體狀，具有蜂蜜自身獨特的香味。蜂蜜的營養(yǎng)成分較為復(fù)雜，主要成分是糖類物質(zhì)，包括單糖、二糖和低聚糖，還含有多酚類化合物、酶類、維生素、蛋白質(zhì)、氨基酸以及礦物質(zhì)等[2]。蜂蜜為天然食品，具有抗菌、消炎、潤肺止咳、潤腸通便、增強心肌功能、降低膽固醇、保肝、促進組織再生和創(chuàng)面愈合等藥用功效[3-5]。因其天然和獨特的功效，蜂蜜越來越為廣大消費者所青睞，需求日益攀升。

蜂蜜應(yīng)密封保存，與空氣隔絕，避免陽光照射，放置在陰涼、干燥、通風的室內(nèi)，不可與其他有異味的物品同放。若蜂蜜在儲存過程中保存不當，吸收空氣中的水分，容易滋生微生物，引起蜂蜜發(fā)酵變質(zhì)，變質(zhì)后形成多種物質(zhì)，包括乙醇、二氧化碳和甘油等，在液體表面產(chǎn)生許多氣泡，對蜂蜜的品質(zhì)和風味均造成不利的影響，降低蜂蜜的食用價值，亦影響消費者的身體健康。因此，迫切需要建立一種快速有效測定甘油含量的檢測方法，從而可參考甘油含量的高低來判斷蜂蜜的變質(zhì)程度。目前，測定蜂蜜中甘油含量的檢測方法有：GB/T 18932.6—2002紫外分光光度法[6]、GH/T 1106—2015氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[7]、高效液相色譜法[8-9]。使用GB/T 18932.6—2002需采購酶制劑試劑盒，價格昂貴，檢測成本高，不利于推廣；GH/T 1106—2015樣品需要經(jīng)過衍生化，對顏色較深的蜂蜜產(chǎn)生干擾，影響甘油含量的準確測定[10]；GH/T 1313—2020高效液相色譜法[8]操作步驟繁瑣，對檢測人員的操作經(jīng)驗和儀器的精度要求較高，市場上難以購置到陰性蜂蜜，制備陰性蜂蜜費時費力。

本文采用混合試劑溶解直接測定蜂蜜中甘油的含量，操作步驟簡單、快速，有效降低企業(yè)的檢測成本，滿足蜂蜜企業(yè)的質(zhì)量控制需求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品：由上海冠生園蜂制品有限公司提供。

試劑：丙三醇(甘油，純度>99%，阿法埃莎(中國)化學有限公司)；甲醇(色譜純，DIKMA)；乙腈(色譜純，DIKMA)；實驗用水為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀(Agilent LC1260，配1260RID檢測器，安捷倫科技有限公司)，分析天平(MS204TS，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)，渦旋振蕩器(VORTEX 3，艾卡(廣州)儀器設(shè)備有限公司)，超聲波清洗器(KQ-100型，昆山市超聲儀器有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1標準曲線的配制

甘油標準貯備溶液：準確稱取2 g甘油于10 mL容量瓶中，用水稀釋、搖勻，濃度為 200 mg/mL。4 ℃密封保存3個月。

甘油工作標準溶液：取適量甘油貯備標準溶液，以與樣品相同的溶劑逐級稀釋得到10 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L和250 mg/L的標準工作溶液。

1.3.2色譜條件

色譜柱：ZORBAX Carbohydrate analysis 4.6×250 mm 5-Micro；流動相：80%乙腈+20%水(v/v)；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：40 μL；示差折光檢測器檢測室溫度：35 ℃。

色譜柱：XBrige? BEH Amide 5 μm 4.6×250 mm Column；流動相：85%乙腈+15%水(v/v)，其他條件如上所示。

1.3.3樣品前處理

稱取蜂蜜樣品5 g(精確至0.000 1 g)至25 mL容量瓶中，加乙腈/甲醇/水混合溶液(3/1/2，v/v)溶解并定容，渦旋振蕩2 min，過0.45 μm有機相濾膜后進高效液相色譜儀分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱的選擇

分別使用ZORBAX Carbohydrate(柱1)和XBrige? BEH Amide(柱2)色譜柱，以乙腈水為流動相，蜂蜜樣品直接溶解進高效液相色譜儀分析。如圖1所示，使用柱2檢測的色譜圖中目標峰后面出現(xiàn)鬼峰，果糖和葡萄糖的色譜峰向右傾斜，可能是因為該色譜柱不適用于含糖量較高的樣品直接測定分析，需凈化除糖。而使用柱1的各個色譜峰峰形對稱，分離較好，故選擇ZORBAX Carbohydrate色譜柱作為后續(xù)研究使用。

柱1： ZORBAX Carbohydrate； 柱2： XBrige? BEH Amide

2.2 流動相的選擇

本文考察了流動相中乙腈/水的體積比分別為75∶25、 80∶20、 85∶15 時對甘油分離的影響。如圖2所示，隨著乙腈比例的增大，甘油出峰時間越晚。乙腈/水比例為85∶15時，目標峰出峰時間為8.3 min，色譜峰峰高下降，峰寬變寬，儀器分析時間較長。乙腈含量較低即比例為75∶25時，目標峰產(chǎn)生拖尾，兩個糖峰和溶劑峰的峰形也較差，80∶20時甘油出峰時間為6.9 min，與雜峰分離，各個色譜峰峰形都對稱，分析時間短。以80∶20乙腈水為流動相。

圖2 不同流動相檢測甘油的色譜圖

2.3 提取溶劑的選擇

蜂蜜的含糖量一般大于70%，主要為果糖和葡萄糖，果糖、葡萄糖和甘油的性質(zhì)相近，較難分離，使用硅膠固相萃取小柱和氧化鋁小柱分離后仍有30%以上蜂蜜糖分殘留，所以選擇合適的溶劑直接溶解。為研究溶劑對蜂蜜中甘油溶解性的影響，分析了表1中幾種溶劑的提取效果，由表1所示，相同稱樣量時溶劑中有機溶劑的含量與檢測靈敏度呈正相關(guān)，并且有機溶劑中乙腈含量越高靈敏度越高。當乙腈/水溶液中添加超過一定閾值的單糖或二糖后，就會出現(xiàn)明顯的相分離現(xiàn)象，溶劑體系6和體系10中果糖和葡萄糖的含量超過閾值產(chǎn)生兩相分離，分析結(jié)果不準確，故稱取5 g樣品時選擇乙腈/甲醇/水(3+1+2)為提取試劑。當樣品中甘油含量較高時，可適當降低稱樣量，增加提取溶劑中乙腈的比例，峰形更佳，稱取2 g樣品時選擇乙腈/甲醇/水(4+1+1)為提取試劑。

表1 溶解對提取效果的影響

2.4 線性范圍和定量限

采用外標法測定蜂蜜中的甘油含量，以甘油的濃度為橫坐標(x)，與該濃度相對應(yīng)的峰面積為縱坐標(y)，建立標準曲線，線性回歸方程為y=316.010 752x+164.796 8，甘油濃度在10 mg/L～250 mg/L濃度范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)為0.999 25，線性良好，根據(jù)信噪比S/N=10計算，得到定量限為50 mg/kg，滿足檢測需求。

2.5 加標回收率

稱取甘油含量為509 mg/kg的蜂蜜樣品，分別添加50 mg/kg，200 mg/kg，500 mg/kg的甘油標準溶液，每個水平重復(fù)測定3次，結(jié)果如表2所示，回收率為94.5%～102.8%，相對偏差為1.05%～2.46%，滿足分析要求。

表2 加標回收率和精密度

2.6 實際樣品的測定

使用本研究方法(HPLC)和GB/T 18932.6—2002(紫外分光光度法UV)分別檢測 3份蜂蜜樣品，結(jié)果見表3，兩種檢測方法得出的檢測結(jié)果比較接近，符合檢測方法要求，說明本研究方法準確、可靠。

表3 不同方法測定蜂蜜中甘油含量的檢測結(jié)果對比

3 結(jié)論

本文建立了以混合溶劑法直接測定蜂蜜中甘油含量的測定方法，該方法前處理操作簡單快速。通過線性范圍、加標回收率、精密度及與其它方法對比等項目的驗證，說明此法測定甘油含量的結(jié)果準確、可靠，并能有效降低檢測成本，可用于蜂蜜生產(chǎn)企業(yè)批量快速測定蜂蜜中甘油的含量，參考檢測結(jié)果來衡量蜂蜜的品質(zhì)。