MALDI-TOF-MS方法快速鑒定食品中空腸彎曲菌的技術研究

吳福平, 吳瑜凡, 崔思宇, 邵景東

1.張家港檢驗認證有限公司，張家港 215600； 2.張家港海關綜合技術中心，張家港 215600； 3.華東理工大學分析測試中心,上海 200237； 4.常州經濟開發區環境衛生管理處,常州 213000

空腸彎曲菌(Campylobacterjejuni,C.jejuni)是革蘭氏陰性菌，菌體彎曲小逗點狀，微需氧，是目前主要食源性病原菌之一，可引起人及動物多種疾病，主要癥狀為腹瀉性腸炎，被認為是細菌性腹瀉的主要原因[1-3]。

目前，空腸彎曲菌鑒定方面主要依據GB/T 4789.9—2014《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 空腸彎曲菌檢驗》的傳統生化來進行，檢測時間較長，且對于深加工食品中由于細菌受到損傷從而導致檢測難度加大。隨著分子生物學技術的發展，熒光定量PCR、16S rRNA基因測序技術、多重PCR法及變形高效液相色譜等方法也越來越多的應用于空腸彎曲菌的檢測，這些方法對于空腸彎曲菌的快速鑒定發揮著重要作用[4-6]。

基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)是近幾年來發展起來的新型快速微生物鑒定技術。其基本原理是，樣品與基質在靶表面形成共晶體薄膜，激光照射，基質吸收能量，將能量轉移樣品解吸，基質和樣品之間發生電荷轉移，樣品電離，經過飛行時間檢測器將質荷比(m/z)不同的離子分開，形成特異性肽蛋白質指紋圖譜。采集圖譜與數據庫比對，從而獲得鑒定結果。目前MALDI-TOF-MS已應用于沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、阪崎腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌等食源性致病菌的快速鑒定，與傳統生化鑒定相比，該技術具備準確、快速、高通量、低成本的檢測優勢，操作簡便，可部分替代傳統生化鑒定和分子生物鑒別方法，適用于對病原微生物的快速篩檢。但因設備成本高，難以在基層實驗室普及，部分微生物數據庫還不夠完整，隨著MALDI-TOF-MS方法的進一步普及和數據庫的不斷完善，上述不足有望得到有效完善[7-13]。本文通過MALDI-TOF-MS方法對樣品前處理的選擇、穩定性、特異性等方面進行研究，確定鑒定空腸彎曲菌的可行性。

1 材料與方法

1.1 試劑與設備

1.1.1供試菌株 標準菌株：空腸彎曲菌CampylobacterjejuniNCTC11168，結腸彎曲菌CampylobactercoliATCC33559,結腸彎曲菌CampylobactercoliATCC43478，胎兒彎曲菌CampylobacterfetusDSM 5361，烏普薩拉彎曲菌CampylobacterupsaliensisDSM 5365，紅嘴鷗彎曲菌CampylobacterlariATCC 35221，豬腸彎曲菌CampylobacterhyointestinalisATCC 35217。從樣品中檢測出經其他生化鑒定方法確認為空腸彎曲菌、結腸彎曲菌的野生分離株共28株，其中空腸彎曲菌25株、結腸彎曲菌3株。

1.1.2培養基與試劑血瓊脂平板，購自北京陸橋技術股份有限公司；α-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)、BTS標準品，購自德國Bruker公司；VITEK2鑒定卡(NH),購自法國生物梅里埃公司；乙腈，無水乙醇，甲酸，三氟乙酸(TFA)。

1.1.3設備 基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(Microflex)，德國Bruker公司生產。微生物實驗室常規滅菌及培養設備，微需氧培養裝置：提供微需氧條件(5% 氧氣、10% 二氧化碳和85% 氮氣)。

1.2 方法

1.2.1細菌分離與純化 參照GB 4789.9—2014《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 空腸彎曲菌檢驗》[14]操作。

1.2.2MALDI-TOF-MS測定

1.2.2.1溶液配制

溶劑I：按照水∶乙腈∶三氟乙酸為50∶47.5∶2.5(v/v)的比例配制，現配現用；BTS標準溶液的配制：用50 μL溶劑I溶解BTS標準品。用移液器反復吹吸溶解BTS粉末，室溫放置5 min，再次溶解，待BTS全部溶解后，瞬時離心，用200 μL PCR管進行分裝，每管5 μL，-20 ℃保存備用。

CHCA基質溶液的配制：在CHCA粉末中加入溶劑I，使CHCA終濃度為10 mg/mL。振蕩混勻，直至溶液澄清。用1.5 mL離心管進行分裝，每管50 μL，用封口膜密封管口，室溫放置備用。放置后，如出現大量沉淀應棄用。

1.2.2.2樣品前處理和點樣

采用直接轉移法、擴展的直接轉移法、甲酸提取法對NCTC 11168空腸彎曲菌標準菌株進行樣品前處理，以考察不同處理方法對鑒定結果的影響。直接轉移法：單菌落在靶點上涂布成薄層，覆蓋1 μL CHCA溶液，自然晾干；擴展的直接轉移法：在直接轉移法的基礎上，中間部分增加覆蓋1 μL 70%甲酸溶液并自然晾干；甲酸提取法：取單個菌落加入300 μL去離子水，振蕩混勻；加入900 μL無水乙醇，混勻，13 000 r/min離心2 min，棄上清液；再次離心除去上清液，室溫干燥3 min；加入30 μL 70%甲酸溶液，吹吸混勻；加入30 μL純乙腈，吹吸混勻，13 000 r/min離心2 min；取1 μL的上清點樣至靶點，自然晾干，覆蓋1 μL CHCA溶液并自然晾干。

1.2.2.3數據采集和結果判定 用標準溶液對儀器校準后進行樣品數據采集和分析。運用FlexControl軟件采集數據，獲得樣品的質譜圖譜；用BioTyper軟件將采集的樣品圖譜與數據庫中的標準圖譜進行比對，根據匹配度判定結果，分值在2.300～3.000，表示菌種鑒定的可信度較高，可完全確認菌株鑒定結果；2.000～2.299表示保守的菌屬鑒定或可能的菌種鑒定，可基本確認鑒定結果；1.700～1.999表示可能的菌屬鑒定，菌株鑒定為不確定結果；0.000～1.699表示鑒定結果不可信。

1.2.2.4特異性試驗 選取在生化和形態學與空腸彎曲菌較為相近的近緣株結腸彎曲菌CampylobactercoliATCC33559,結腸彎曲菌CampylobactercoliATCC43478，胎兒彎曲菌CampylobacterfetusDSM 5361，烏普薩拉彎曲菌CampylobacterupsaliensisDSM 5365，紅嘴鷗彎曲菌CampylobacterlariATCC 35221，豬腸彎曲菌CampylobacterhyointestinalisATCC 35217，以及分離到的3株結腸彎曲菌疑似菌株進行MALDI-TOF數據采集，并在VITEK結果比對,評價MALDI-TOF-MS鑒定的準確性。

1.2.2.5穩定性試驗 通過對比空腸彎曲菌NCTC11168同一傳代次數的不同菌落及不同傳代次數的鑒定結果，評價MALDI-TOF-MS鑒定的穩定性。

1.2.3VITEK2鑒定 VITEK2 compact全自動微生物鑒定系統進行生化鑒定。

1.2.4分離菌株鑒定 25株樣品分離菌株MALDI-TOF-MS技術鑒定，與VITEK結果相比較。

2 結果

2.1 樣品處理方法選擇結果三種樣品處理方法下空腸彎曲菌NCTC11168的可信度得分均在2.300以上，說明鑒定結果可靠。與其他兩種樣品處理方法相比，甲酸提取法蛋白指紋圖譜的基線平滑、峰強度高(圖1)，信噪比高，更適用于后續數據分析。不同的樣品處理對MALDI-TOF-MS的鑒定結果有一定影響，選擇合適的樣品處理方法是保證MALDI-TOF-MS準確鑒定的前提。

圖1 三種前處理方法對空腸彎曲菌NCTC11168處理后的MALDI-TOF-MS峰圖

2.2 特異性MALDI-TOF-MS檢測空腸彎曲菌及其近緣株的結果表明，該方法可以準確區分空腸彎曲菌和其近緣菌株，無假陽性或假陰性結果發生(見表1)。

表1 MALDI-TOF-MS檢測空腸彎曲菌及其近緣株的結果

2.3 穩定性由穩定性試驗結果(表2)顯示，空腸彎曲菌NCTC11168同一傳代次數的3個菌落平行樣的可信度得分非常接近，且不同傳代次數的可信度得分無顯著性差異。

表2 MALDI-TOF-MS檢測空腸彎曲菌穩定性試驗結果

2.4 25株分離菌株鑒定結果結果表明：MALDI-TOF-MS鑒定結果與生化鑒定結果一致，均鑒定為空腸彎曲菌，且MALDI-TOF-MS菌種鑒定的可信度較高(表3)。

表3 25株分離菌株的MALDI-TOF-MS與VITEK鑒定結果

3 討論

通過比較不同樣品處理方法對空腸彎曲菌MALDI-TOF-MS鑒定結果的影響，結果發現甲酸提取法得到的結果蛋白峰數量和高度較另外兩種方法更穩定。

本文選取6株與空腸彎曲菌相近且較難區分的近緣彎曲菌屬標準菌株進行研究。MALDI-TOF-MS鑒定結果表明，MALDI-TOF-MS能夠準確快速的區分彎曲菌近緣菌株，相較于傳統生化方法在時效性上均有較大提高。通過與VITEK生化結果比對，兩者結果高度一致。

空腸彎曲菌NCTC11168同一傳代次數的3個菌落平行樣的可信度得分非常接近，且不同傳代次數的可信度得分無顯著性差異，說明空腸彎曲菌MALDI-TOF-MS鑒定方法的穩定性較好，同一代次及不同代次的鑒定結果具有很好的一致性。

25株樣品分離菌株MALDI-TOF-MS鑒定結果與VITEK生化結果一致，均鑒定為空腸彎曲菌，且MALDI-TOF-MS菌種鑒定的可信度較高。說明本研究建立的空腸彎曲菌MALDI-TOF-MS鑒定方法準確度高，可用于空腸彎曲菌快速、準確的鑒定。

綜上所述，MALDI-TOF-MS方法具有操作簡單、快速、高通量、準確度高等優點，方法可用于食品中空腸彎曲菌的快速篩檢，也為其它食源性致病菌快速鑒定方法的建立提供參考，有望發展成為新的檢測標準化方法。