超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜內(nèi)標法測定雞肉中金剛烷胺殘留量的不確定度評定

◎ 朱飛如，馮俊富，余開科，麥運佳，李 峰

(北海市食品藥品檢驗所，廣西 北海 536000)

金剛烷胺又名三環(huán)癸胺、金剛胺，屬于三環(huán)胺類藥物，1960年首次人工合成[1]。經(jīng)查閱文獻，金剛烷胺這種藥物，最開始被用于抑制流感病毒，在1966年被國際上批準為預(yù)防藥，1976年在預(yù)防藥的基礎(chǔ)上又確認為治療藥[2-3]。在畜牧養(yǎng)殖方面，金剛烷胺主要用在治療和預(yù)防禽類流感，其容易引起副作用主要在兩方面，一是精神異常，二是日益增加的耐藥性，危害著消費者的身體健康，同時也對畜禽產(chǎn)品的安全監(jiān)管帶來極大挑戰(zhàn)。我國農(nóng)業(yè)部2017年印發(fā)獸藥殘留監(jiān)控計劃的通知中，第一個監(jiān)控項目是金剛烷胺，由此看出控制金剛烷胺的重要性[4]。金剛烷胺抗病毒獸藥使用，給消費者身體帶來極大的危害。2005年10月農(nóng)業(yè)部發(fā)布第560號公告，禁止金剛烷胺等抗病毒獸藥的生產(chǎn)和使用[5]。

目前文獻報道的測定金剛烷胺方法主要包括毛細管氣相色譜法[6]、高效液相色譜-熒光檢測法[7]和液質(zhì)聯(lián)用法[8]等。隨著檢測要求的提高，數(shù)據(jù)要求更加精準，以便加強監(jiān)管，實驗室控制數(shù)據(jù)質(zhì)量的一個重要步驟是測量不確定度，它不單在科學(xué)上有著重要意義，在現(xiàn)實上也有重要意義[9]。在許多在儀器操作方面都有廣泛的應(yīng)用，如理化實驗、儀器操作等[10-16]。本研究根據(jù)《化學(xué)分析測量不確定度評定》（JJF 1135—2005）[17]和《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012）[18]，對國標《食品安全國家標準動物性食品中金剛烷胺殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》[19]中超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜內(nèi)標法檢測雞肉中金剛烷胺殘留量的不確定度進行評定，建立了雞肉中金剛烷胺殘留量的不確定度評定方法，推斷出測量不確定度結(jié)果的主要來源和影響實驗數(shù)據(jù)準確度的主要因素，為加強實驗室質(zhì)量控制提供更加科學(xué)、可信和準確的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

金剛烷胺（99.05%，Stanford Chemicals）；D15-金剛烷胺（99.20%，Stanford Chemicals）；甲醇（色譜純，美國Fisher公司）；乙腈（色譜純，美國Fisher公司）；正己烷（色譜純，美國Merck公司）；冰乙酸（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；甲酸（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；無水硫酸鈉（優(yōu)級純，天津市光復(fù)精細化工研究所）。

1290/6460 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；XA205DU電子天平（MAX 81g/220 g，d=0.01 mg/0.1 mg，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；本實驗使用玻璃量器均是A級。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件

色 譜 柱：ZORBAX SB-C18（2.1 mm×150 mm，3.5 μm），流速：0.3 mL·min-1，柱溫：30 ℃，進樣量：10 μL；流動相A：0.1%甲酸水溶液，流動相B：甲醇；梯度洗脫：0～1.5 min，維持10% B；1.5～2 min，10% B線性變化至90% B；2～5 min，維持90% B；5～5.1 min，90% B線性變化至10% B；5.1～10 min，維持10% B。

1.2.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧（ESI），正離子模式；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測（Multiple reaction monitoring，MRM）；監(jiān)測離子見表1。

表1 被測物的母離子和子離子參數(shù)表

1.2.3 標準工作溶液的制備

金剛烷胺標準儲備液：精密稱取標準品金剛烷胺0.010 20 g于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋定容至刻度，搖勻，即得；金剛烷胺標準中間液：精密量取金剛烷胺標準儲備液1 mL于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得；金剛烷胺標準工作液A：精密量取金剛烷胺標準中間液1 mL于100 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得；金剛烷胺標準工作液B：精密量取金剛烷胺標準工作液A 1 mL于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得；金剛烷胺標準工作液C：精密量取金剛烷胺標準工作液B 2 mL于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得；D15-金剛烷胺標準儲備液：精密稱取D15-金剛烷胺標準品0.000 90 g于1 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得；D15-金剛烷胺標準中間液：精密量取D15-金剛烷胺標準儲備液0.1 mL于100 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得；D15-金剛烷胺標準工作液：精密量取D15-金剛烷胺標準中間液1 mL于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

分別加入金剛烷胺標準工作液C 50 μL、100 μL，金剛烷胺標準工作液B 50 μL、100 μL，金剛烷胺標準工作液A 50 μL、100 μL，分別加入D15-金剛烷胺標準工作液100 μL，分別加入空白基質(zhì)溶液350 μL、300 μL、350 μL、300 μL、350 μL 和300 μL，配制成標曲 1 ～ 6 濃度分別為 2.02 μg·L-1、4.04 μg·L-1、10.10 μg·L-1、20.21 μg·L-1、101.03 μg·L-1和 202.06 μg·L-1的標準系列溶液。

1.2.4 樣品的處理

稱取試料2 g，于50 mL離心管中，加D15-金剛烷胺標準工作液200 μL，加1%乙酸乙腈溶液10 mL，漩渦2 min，離心5 min（轉(zhuǎn)速為3 000 r·min-1），上清液轉(zhuǎn)入另一50 mL離心管中，重復(fù)提取一次，合并兩次上清液，加無水硫酸鈉3 g、正己烷10 mL，渦旋1 min，3 000 r·min-1離心5 min，棄去正己烷層，剩余溶液轉(zhuǎn)至100 mL雞心瓶中，40 ℃水浴下旋轉(zhuǎn)蒸干，用1.0 mL甲醇溶解殘渣。加入PSA 50 mg，渦旋30 s，取上清液過濾膜至1.5 mL試管中。量取濾液0.5 mL于離心管中，40 ℃氮氣吹干，加入50%乙腈水溶液0.5 mL，渦旋 30 s，10 000 r·min-1離心 5 min，取上清液供上機測定。

1.2.5 空白溶液的制備

除未加樣品外，其他操作參照“1.2.4”，制備空白溶液。

2 數(shù)學(xué)模型

雞肉中金剛烷胺殘留量的數(shù)學(xué)模型為：

式中：X-樣品中金剛烷胺殘留量，μg·kg-1；C-從標準曲線得到金剛烷胺的質(zhì)量濃度，μg·L-1；V-溶解殘渣的甲醇體積，mL；m-樣品的質(zhì)量，g。

3 不確定度來源分析

從檢測過程和數(shù)學(xué)模型分析可知，影響雞肉中金剛烷胺殘留量的不確定度因素主要有：稱量樣品引入的不確定度urel(m)；溶解殘渣的甲醇體積引入的不確定度urel(v)；配置標準曲線引入的不確定度urel(C)；標準曲線擬合引入的不確定度urel(I)；重復(fù)測量樣品的不確定度urel(x)。

4 不確定度的評估

4.1 稱量樣品引入的不確定度urel(m)

使用萬分之一電子天平，稱取2.000 0 g試樣，查閱其檢定證書可知，當稱樣范圍在0～50 g時，其最大允許誤差為±0.000 5 g，按均勻分布則稱量樣品引入的標準不確定度為：

則稱量樣品的相對標準不確定度為：

4.2 溶解殘渣的甲醇體積引入的不確定度urel(v)

4.2.1 移液器體積校準引入的不確定度u1(v)和u2(v)

溶解殘渣的甲醇體積為1 mL，根據(jù)《移液器檢定規(guī)程》（JJG 646—2006）[20]，用1 mL移液器移取1 mL的容量允差為±1.0%，測量重復(fù)性為0.5%，按均勻分布則移液器體積校準引入的相對標準不確定度為：

4.2.2 溫度引入的標準不確定度u3(v)

實驗室保持溫度范圍在（20±5）℃，甲醇的膨脹系數(shù)是1.19×10-3/℃，其按均勻分布則溫度引入的相對標準不確定度是：

則溶解殘渣的甲醇體積的相對標準不確定度為：

4.3 實驗標準曲線配制引入的不確定度urel(C)

4.3.1 標準品引入的不確定度urel(C1)

查閱證書可知，標準品金剛烷胺含量為99.05%，不確定度為±1.0%；D15-金剛烷胺含量為99.20%，不確定度為±1.0%；當樣品待測液和標準系列溶液中內(nèi)標物含量一致時，儲備液配制、中間液配制、工作液配制和內(nèi)標物的純度等均不對樣品中的目標物含量帶來影響，故本文僅評估內(nèi)標物加入體積引入的不確定度[21]。

則金剛烷胺引入的相對標準不確定度為：

4.3.2 標準品稱量引入的不確定度urel(C2)

使用十萬分之一電子天平，稱取標準品金剛烷胺0.010 20 g，根據(jù)檢定證書當稱樣范圍在0～5 g時，其最大允許誤差為±0.000 05 g，按均勻分布（則金剛烷胺標準品稱量引入的標準不確定度為：

則金剛烷胺標準品稱量的相對標準不確定度為：

4.3.3 標準儲備液的配制引入的不確定度urel(C3)

標準儲備液是將標準物質(zhì)用甲醇溶解并定容于10 mL量瓶中。

（1）玻璃量器體積校準引入的不確定度u1(C3)。查閱JJG 196—2006[22]可知，10 mL A級標準的容量瓶，容量允差為±0.020 mL，按均勻分布則玻璃量器體積校準引入的標準不確定度為：

（2）溫度引入的標準不確定度u2(C3)。實驗室保持溫度范圍（20±5）℃，甲醇的膨脹系數(shù)是1.19×10-3/℃，其按均勻分布則溫度引入的標準不確定度為：

則標準儲備液的配制引入的不確定度為：

標準儲備液的配制引入的相對標準不確定度為：

4.3.4 標準中間液和標準工作液的配制引入的不確定度urel(C4)

標準中間液是標準儲備液1 mL用甲醇溶解并定容于10 mL量瓶中；標準工作液A是取標準中間液1 mL用甲醇溶解并定容于100 mL量瓶中；標準工作液B是取標準工作液A 1 mL用甲醇溶解并定容于10 mL量瓶中；標準工作液C是取標準工作液B 2 mL用甲醇溶解并定容于10 mL量瓶中。

根據(jù)《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196—2006）[22]，配置標準中間液和標準工作液引入的相對標準不確定度見表2。由表2可知，標準中間液和標準工作液的配制引入的不確定度urel(C4)為0.012 5。

表2 標準中間液和標準工作液引入的相對標準不確定度表

4.3.5 配制標準曲線過程引入的不確定度urel(C5)

由“1.2.3”標準系列溶液的配制可知，50 μL使用了3次，100 μL使用了9次，水的體積膨脹系數(shù)：2.1×10-4/℃，乙腈的體積膨脹系數(shù)：1.37×10-3/℃，則50%乙腈水的平均體積膨脹系數(shù)為3.95×10-4/℃，根據(jù)《移液器檢定規(guī)程》（JJG 646—2006）[20]，配制標準曲線過程引入的相對標準不確定度見表3，由表3可知，配制標準曲線過程引入的不確定度urel(C5)為0.051 4。

表3 標準曲線配制過程引入的相對標準不確定度表

綜上所述，配制標準曲線引入的不確定度urel(C)為

=0.053 4。

4.4 擬合標準曲線引入的不確定度urel(I)

取標曲1～6系列濃度各測定2次，橫坐標為標準溶液濃度，縱坐標為標準溶液色譜峰面積與內(nèi)標峰面積比值，做線性擬合而成的線性回歸方程：I=bc+a（b為斜率，a為截距），測定數(shù)據(jù)及計算結(jié)果表4。

表4 標準曲線數(shù)據(jù)表

標準曲線變動性的標準差為：

式中：SR表示標準曲線的標準差；n表示標準曲線校準點測量次數(shù)；Ii表示測定的標準溶液色譜峰面積與內(nèi)標峰面積比值；b表示校準曲線的斜率；ci表示標準溶液含量，μg·L-1，a表示校準曲線的截距。

用該曲線對樣液重復(fù)測定6次，樣液中含量平均值為82.03 μg·L-1，曲線擬合引入的標準不確定度為：

式中：SR表示標準曲線的標準差；n表示標準曲線校準點測量次數(shù)；p表示被測樣品測定次數(shù)；b表示校準曲線的斜率；表示樣液中含量平均值，mg·L-1；ci表示標準溶液含量，mg·L-1；

則曲線擬合引入的相對標準不確定度為：

4.5 樣品重復(fù)測量的不確定度urel(x)

對樣品重復(fù)測定6次的結(jié)果見表5。

表5 樣品測定結(jié)果表

用貝塞爾公式計算樣品重復(fù)測定的標準偏差為：

式中：s表示標準偏差；n表示測量次數(shù)；xi表示樣品的測定值，單位μg·kg-1；X—表示n次測定的算術(shù)平均值，單位 μg·kg-1。

樣品重復(fù)測定平均值的標準不確定度為：

樣品重復(fù)測定平均值的相對標準不確定度為：

4.6 合成標準不確定度urel

雞肉中金剛烷胺殘留量的相對標準不確定度匯總見表6。

表6 金剛烷胺殘留量不確定度分量總結(jié)表

則其合成相對標準不確定度為：

4.7 擴展不確定度的評定

合成標準不確定度：u=urel×x—=0.055 5×41.013=2.28 μg·kg-1，取擴展因子k=2（95% 置信率），則擴展不確定度：U=2u=2×2.28=4.56 μg·kg-1。金剛烷胺殘留量的測定結(jié)果為：X=（41.01±4.56）μg·kg-1（k=2）。

5 結(jié)論

通過不確定度的分析可知，標準曲線制備和標準曲線擬合是測量雞肉中金剛烷胺殘留量不確定度的主要來源。對此，要注意實驗過程中標準曲線的制備、標準曲線的擬合，這兩個因素影響測定結(jié)果的準確度和可信度。使用精確度更高，經(jīng)過嚴格檢定的玻璃量器，或增加標準曲線的測定次數(shù)，嚴格規(guī)范實驗操作各個步驟，配制濃度范圍符合檢測項目實測值的標準曲線等，可大大降低測定結(jié)果的不確定度，多舉措、多方位提高實驗結(jié)果的可信度。