超高效液相色譜-質譜法同時測定水產品中硝基呋喃類代謝物、孔雀石綠及氯霉素殘留量的方法驗證

◎ 母昌立，王 蓓，遲志娟，王 姣，周益政，王淳純，劉培培

（1.江蘇省太倉市農產品質量監督檢驗測試中心，江蘇 太倉 215412；2.北京六角體科技發展有限公司，北京 101102）

在《食品動物中禁止使用的藥品及其他化合物清單》（中華人民共和國農業農村部公告 第250號）中明令禁止孔雀石綠、硝基呋喃類、氯霉素等3類6種藥物在水產養殖中使用，在動物性食品中不得檢出。為此，國家相關部門出臺了相應的檢測標準[1-3]。除了國家標準檢測方法之外，針對3類6種藥物的殘留檢測，國內外文獻也相繼報道了酶聯免疫吸附法[4]、色譜法[5]、質譜法[6-9]。

綜合上述檢測標準及文獻報道，沒有3類6種藥物同時前處理進行檢測的報道，因此，本文驗證了北京六角體科技發展有限公司生產的水產品中孔雀石綠、硝基呋喃類代謝物、氯霉素前處理試劑盒在本實驗室的適用性。此次驗證包括產品適用范圍、標準曲線、線性相關系數、檢測靈敏度、檢測精密度及方法回收率。

1 材料與方法

1.1 材料

本方法以鯽魚、河蝦和河蟹為試驗材料，驗證該產品是否滿足本實驗室的要求。

1.2 試劑與耗材

水產品中孔雀石綠、硝基呋喃類代謝物、氯霉素前處理試劑盒（包含檢測試劑A、檢測試劑B和固相萃取柱），北京六角體科技發展有限公司；呋喃唑酮代謝物（AOZ）、阜南他酮代謝物（AMOZ）、呋喃西林代謝物（AHD）和呋喃妥因代謝物（SEM）混合標準溶液、氯霉素（CAP）標準溶液、孔雀石綠（MG）和隱色孔雀石綠（LMG）混合標準溶液、氯霉素-D5標準溶液、AOZ-D4、AMOZ-D5、AHD-13C3和SEM-13C15N2混合標準溶液、孔雀石綠-D5和隱色孔雀石綠-D5混合標準溶液、氯霉素-D5標準溶液，以上標準溶液濃度均為100 mg·L-1，天津阿爾塔科技有限公司；乙酸銨（色譜純）、甲醇（色譜純、乙腈（色譜純、正己烷（色譜純）和甲酸（色譜純），美國Fisher公司；GHP微孔濾器（0.22 μm），美國Waters公司；魚肉粉中孔雀石綠（含隱色孔雀石綠）質控樣，大連中食國實檢測技術有限公司。

1.3 儀器與設備

5500型高效液相色譜-串聯質譜儀：美國AB公司；3-18K高速離心機：德國Sigma公司；渦旋振蕩器：德國IKA公司；恒溫水浴鍋（DK-600）：上海冉繪實業有限公司。

1.4 前處理方法

取絞碎的試料4.0 g置離心管中，加100 ng·mL-1的氯霉素 -D5標準工作液，AOZ-D4、AMOZ-D5、AHD-13C3、SEM·HCl-(1，2-15N2，13C)混合標準工作液和孔雀石綠-D5和隱色孔雀石綠-D6混合標準工作液各100 μL，再加4.0 mL檢測試劑A，1.0 mL衍生化試劑，充分混勻后，65 ℃超聲提取20 min，其間搖勻2～3次。超聲后加入2.5 mL檢測試劑B，振蕩混勻，加入一管提取劑1、5.0 mL提取劑2，振蕩10 min，8 000 r·min-1離心5 min。

用5.0 mL提取劑2活化固相萃取柱，取3.0 mL上清液過活化后的固相萃取柱，并擠干柱體，用離心管接流出液，備用。用2.0 mL乙腈+0.5 mmol·L-1乙酸銨緩沖溶液（75+25，v/v）洗脫固相萃取柱，收集洗脫液，渦旋混勻后備用。

硝基呋喃類代謝物、氯霉素待測液：取1.0 mL洗脫液添加到流出液中，50 ℃下氮氣吹干，用1.0 mL水復溶，再用1.0 mL正己烷去除油脂，下層即為硝基呋喃類代謝物和氯霉素的待測液，經0.22 μm濾膜，供高效液相色譜-串聯質譜法測定。

孔雀石綠待測液：剩余洗脫液即為孔雀石綠待測液，經0.22 μm濾膜，供高效液相色譜-串聯質譜法測定。

1.5 檢測方法

1.5.1 硝基呋喃類代謝物檢測方法

硝基呋喃類代謝物的檢測參照母昌立等[9]的方法。

1.5.2 氯霉素檢測方法

色譜柱：C18，50 mm×2.1 mm，3 μm；流動相：水（A）+甲醇（B）=60+40；流速：0.5 mL·min-1；進樣量：5 μL；柱溫：40 ℃；離子源：電噴霧ESI，負離子；掃描方式：多反應監測MRM；氣簾氣：206.84 kPa（30.0 psi）；霧化氣：344.73 kPa（50.0 psi）；輔助氣：344.73 kPa（50.0 psi）；離子源溫度：550 ℃。監測離子對及對應質譜參數見表1。

1.5.3 孔雀石綠檢測方法

色譜柱：C18，50 mm×2.1 mm，3 μm；流動相：乙腈 +5 mmol·L-1乙酸銨 =75+25；0.5 mL·min-1；進樣量：1 μL；柱溫：40 ℃；離子源：電噴霧ESI，正離子；掃描方式：多反應監測MRM；氣簾氣：206.84 kPa（30.0 psi）；霧化氣：344.73 kPa（50.0 psi）；輔助氣：344.73 kPa（50.0 psi）；離子源溫度：550 ℃。監測離子對及對應質譜參數見表1。

表1 氯霉素、孔雀石綠及其同位素標記物的主要質譜參數表

1.6 標準曲線的制作

1.6.1 硝基呋喃類代謝物標準曲線制作

精密量取適量的AOZ、AMOZ、AHD、SEM混合標準工作液，置于不同離心管中。按1.4處理，制得0.2 ng·mL-1、0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、4.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1和 20.0 ng·mL-1系列濃度，利用1.5.1方法進行測定，每個濃度測定2次。

1.6.2 氯霉素和孔雀石綠標準曲線制作

分別精密量取適量的100 ng·mL-1的氯霉素和孔雀石綠標準工作液于10 mL容量瓶中，加入100 ng·mL-1的對應同位素內標標準工作液250 μL，用流動相定容，制得 0.2 ng·mL-1、0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、4.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1和 20.0 ng·mL-1系列濃度，利用1.5.2和1.5.3進行測定，每個濃度測定2次。

1.7 靈敏度的驗證

在對應標準中，硝基呋喃類代謝物在動物源食品中的檢測限為 0.25 ng·g-1，定量限為 0.50 ng·g-1[1]，氯霉素在動物源食品中的檢測限為0.1 ng·g-1，定量限為0.2 ng·g-1[3]，孔雀石綠和隱色孔雀石綠動物源食品中的檢測限為0.5 ng·g-1[2]。在每種樣品中加入適量的目標化合物標準溶液，使各化合物在樣品中的濃度分別為檢測限和定量限，重復10次，按照1.4進行前處理，1.5進行檢測。若濃度為檢測限時，信噪比≥3，則檢測限滿足要求；若濃度為定量限時，信噪比≥10，則定量限滿足要求[10]。

1.8 精密度的驗證

《食品動物中禁止使用的藥品及其他化合物清單》（中華人民共和國農業農村部公告 第250號）規定，硝基呋喃類代謝物、氯霉素和孔雀石綠均為禁用藥物，在動物性食品中均不得檢出。因此，在添加濃度為檢測限、2倍檢測限和10倍檢測限3個濃度[11]，每種樣品每個濃度重復10次，計算相對標準偏差。

1.9 回收率的驗證

在每種樣品中加入適量的待測物混合標準溶液，使其在樣品中的濃度分別為檢測限、2倍檢測限和10倍檢測限濃度，每種樣品每個濃度重復10次，按照1.4進行前處理，1.5進行檢測。

2 結果與分析

2.1 標準曲線

以目標物的濃度為橫坐標，對應濃度目標物峰面積與相應同位素內標峰面積比值為縱坐標，得到各目標物的標準曲線線性方程及相關系數（見表2）。由表2看出，各待測物線性方程的相關系數均大于0.99，相關性良好，可用于準確定量[11]。

表2 AOZ、AMOZ、AHD、SEM、CAP、MG和LMG的線性方程及相關系數表

2.2 靈敏度

在每種樣品中加入適量的待測物混合標準溶液，使其在樣品中的濃度分別為檢測限和定量限濃度，重復10次。經檢測發現，當待測物濃度為檢測限濃度時，信噪比均＞3；待測物濃度為定量限濃度時，信噪比均＞10。由此可見，本產品的方法檢測限和定量限均滿足實驗室的要求。

2.3 精密度和回收率

每種樣品在檢測限、2倍檢測限和10倍檢測限3個濃度進行檢測，重復10次，檢測后得到表3所示結果。由表3可以看出，6種化合物在鯽魚、河蝦和河蟹中添加回收率均在60%～120%，相對標準偏差＜30%，滿足各對應檢測標準的要求。

表3 AOZ、AMOZ、AHD、SEM、CAP、MG和LMG在鯽魚、河蝦和河蟹的精密度和添加回收率表

2.4 質控樣測定

利用1.4的前處理方法處理魚肉粉中孔雀石綠（含隱色孔雀石綠）質控樣，利用1.5.3的檢測方法進行檢測，檢測結果與質控樣證書相符。

3 結論

經過驗證，北京六角體科技發展有限公司生產的水產品中孔雀石綠、硝基呋喃類代謝物、氯霉素前處理試劑盒的適用范圍、標準曲線、線性相關系數、檢測靈敏度、檢測精密度及方法回收率均滿足要求。本實驗室利用此產品對購自大連中食國實檢測技術有限公司的魚肉粉中孔雀石綠（含隱色孔雀石綠）質控樣進行測定，檢測結果滿意。