桶裝水中銅綠假單胞菌檢驗方法的建立

◎ 樊惠華，侯磊磊，米林鋒，柴梅梅，郭 蓉

（榆林市食品檢驗檢測中心，陜西 榆林 719000）

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）是一種重要的食源性和水源性致病菌，因其能夠在低營養的水環境中生存而廣泛存在于水中，是化膿性感染的重要致病菌之一[1]。銅綠假單胞菌屬于條件致病菌，對抵抗力較弱的人群存在較大的健康風險。飲用水中如果含有銅綠假單胞菌，被人大量飲用或被胃腸黏膜有損傷的病人、嬰幼兒飲用，可能會導致腹瀉，嚴重者甚至可能感染該菌并引發相關疾病[2]。由于銅綠假單胞菌具有較大的危害性，美國、加拿大、日本、巴西及世界衛生組織等多數國家和國際組織對飲用水中銅綠假單胞菌含量標準的要求是每250 mL不得檢出。《食品安全國家標準 包裝飲用水》（GB 19298—2014）微生物限量銅綠假單胞菌指標，明確規定銅綠假單胞菌是必檢項之一，且每250 mL水樣中銅綠假單胞菌不得檢出。該標準自2015年5月24日起實施，并且要求企業出廠前對每批次成品進行銅綠假單胞菌檢測。如果檢出銅綠假單胞菌，則為不合格產品，應該停止銷售。同時，對已在市場上流通的超標桶裝水必須召回。

近年來，桶裝水因其潔凈衛生、不含雜質、便利等優點消費量不斷上升，在家庭和公共場所得到廣泛地使用。然而，關于銅綠假單胞菌污染桶裝水的報道也逐漸增多，甚至報道出食物中毒的事件[3-4]。榆林市食品檢驗檢測中心自2017年取得檢驗檢測機構資質認定以來，于2019年對市60多家水廠的桶裝水進行專項和監督抽檢檢驗，發現不合格率達到10%左右，幾乎都是銅綠假單胞菌超標所致，桶裝水的安全令人擔憂。目前，桶裝水中銅綠假單胞菌檢測技術可分為2類，分別為傳統國標檢驗方法和以分子生物學技術為基礎的快檢方法，其中傳統方法主要是GB 8538—2016中的濾膜法以及改進培養基的銅綠假單胞菌培養方法；快速檢測方法則涉及Kirby-Bauer紙片擴散法和以PCR技術為基礎的隨機擴增多態性DNA（Random Amplified Polymorphic，RAPD）分型法等。桶裝水的市場監管中主要應用傳統的國標檢測方法，快速檢測的方法因其對檢驗人員的技術要求較高，不適用于一些中小型水廠的出廠檢驗。

本文針對榆林市的水廠實際狀況，為提高大型水廠、中小型水廠或者小型水廠銅綠假單胞菌的現場檢驗效率，在國標的基礎上通過單向負壓吸附取液微孔濾膜過濾裝置取代傳統的百級潔凈環境中抽濾系統完成銅綠假單胞菌的初步檢驗，與國際方法檢驗過程比較，具有對檢測環境要求低、操作簡單的優越性，可推廣應用于本市桶裝水生產廠家生產的不同規格桶裝飲用水銅綠假單胞菌的出廠檢驗。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

檢驗用的水樣為榆林市市場銷售的榆陽泉品牌桶裝飲用水，樣品在保質期內。

1.2 標準菌株

銅綠假單胞菌（ATCC 27853）、熒光假單胞菌（ATCC 13525），均購自廣東環凱生物技術有限公司。

1.3 儀器與試劑

單向負壓吸附取液微孔濾膜過濾裝置包括取液管，其進液端設置有斜向穿刺口，其出液端連接有單向閥；過濾器，其進液端與單向閥連接，其出液端連接有截止閥；負壓計量瓶，其進液端通過連接管與截止閥連接，其出液端通過導氣管與負壓真空泵連接；過濾器內設置有濾腔，濾腔內填充有過濾介質。采用的過濾介質為微孔濾膜，具體操作過程包括：器械組裝→消毒→無菌穿刺引流→負壓流量控制→定量吸附過濾→制備樣貯藏→運輸→潔凈區濾膜轉移→轉入生化培養。該裝置為榆林市食品檢驗檢測中心專利產品[5]，見圖1。

圖1 單向負壓吸附取樣過濾裝置圖

SSM-6不銹鋼過濾系統，天津奧特賽恩斯儀器有限公司；直徑為50 mm，孔徑為0.45 μm水系過濾膜，購自浙江泰林生物技術有限公司；直徑為47 mm，孔徑為0.45 μm水系過濾膜，購自廣東環凱微生物科技有限公司；BXM-75V立式高壓蒸汽滅菌器，BXS-250可擴展試驗箱，上海博訊醫療生物儀器股份有限公司；HFsafe 1500TE生物安全柜，上海三申醫療器械有限公司。

CN瓊脂及配套試劑，購自北京陸橋技術股份有限公司；營養瓊脂、腦心浸出液肉湯、乙酰胺肉湯、綠膿菌素測定用培養基、納氏試劑和氧化酶試紙，購自青島海博生物技術有限公司。

1.4 方法

1.4.1 單向負壓吸附取液微孔濾膜過濾裝置與不銹鋼過濾系統對銅綠假單胞菌檢測方法比較

取銅綠假單胞菌（ATCC 27853）標準菌株F2代接種于BHI肉湯，36 ℃培養18～24 h，用無菌移液管吸取10 μL于500 mL無菌生理鹽水中，制備陽性母液。依據《食品安全國家標準 飲用天然礦泉水檢驗方法》（GB 8538—2016）中銅綠假單胞菌檢驗方法，對水樣進行銅綠假單胞菌檢測。

根據樣品的污染情況，將陽性水樣稀釋至10-6稀釋度，每一個梯度分別用兩種過濾裝置進行，不銹鋼過濾系統編號為A組，單向負壓吸附取液微孔濾膜過濾裝置編號為B組。A組量取250 mL水樣用直徑為47 mm，孔徑為0.45 μm水系過濾膜過濾；B組量取250 mL水樣用直徑為50 mm，孔徑為0.45 μm水系過濾膜過濾，然后將濾膜平鋪在制備好的CN瓊脂平板上。平板于恒溫培養箱內（36±1）℃培養40～48 h，在培養20～24 h和40～48 h后觀察濾膜上菌落的生長情況并計數。銅綠假單胞菌在CN瓊脂上生長的菌落選擇和驗證步驟有3種：計數所有顯藍色或綠色（綠膿色素）疑似銅綠假單胞菌的菌落，并進行綠膿菌素確證性試驗；計數濾膜上所有發熒光不產綠膿色素疑似銅綠假單胞菌菌落，并進行乙酰胺肉湯確證性試驗；將其他所有紅褐色不發熒光的菌落進行氧化酶測試及乙酰胺液體培養基、金氏B培養基確證性試驗。

1.4.2 數據處理方法利用SPSS在線軟件對A組和B組銅綠假單胞菌檢測計數數據進行相關分析，相關系數接近1，二者具有完美的正相關關系。

1.4.3 單向負壓吸附取液微孔濾膜過濾裝置聯合驗證試驗

選7家有銅綠假單胞菌CMA檢測能力的實驗室，組成聯合驗證小組，統一驗證工作程序，統一檢測方法，統一陽性菌母液和單向負壓吸附取液微孔濾膜過濾裝置。根據1.4.1銅綠假單胞菌計數結果于300 mL陽性母液中加入400 mL無菌生理鹽水，終濃度控制在400 CFU·mL-1左右，分裝成7個100 mL陽性母液冷藏貯存，24 h內運送至7家實驗室，同一時間時分別提取2 mL、20 mL和30 mL的母液量加入3桶同一批次18.9 L榆陽泉品牌桶裝水進行銅綠假單胞菌檢測驗證，編號A樣、B樣和C樣。

2 結果與分析

2.1 兩種過濾裝置檢測結果對比分析

分別用兩種過濾裝置對第1 d、第3 d、第5 d的水樣進行銅綠假單胞菌檢測（如圖2所示），將A組和B組銅綠假單胞檢測數據進行相關分析，A組和B組之間的相關系數值為0.997，并且呈現出0.01水平的顯著性，因而說明A組和B組之間有著顯著的正相關關系。具體結果見表1。

圖2 A組和B組10-3稀釋度第1 d、第3 d、第5 d的水樣銅綠假單胞菌檢測結果圖

表1 不同天數不同稀釋度銅綠假單胞菌計數結果表

2.2 實驗室間檢測結果比對分析

因桶裝水中雜菌較多，陽性母液長距離配送造成數量減少和桶裝水中銅綠假單胞菌分布不均勻等原因影響銅綠假單胞菌的計數結果，反饋結果只做定性分析。7家實驗室采用單向負壓吸附取液微孔濾膜過濾裝置聯合驗證銅綠假單胞菌檢測反饋結果統計見表2。結果顯示，除榆林市食品檢驗檢測中心實驗室A、B、C樣均檢出，檢出比為100%；其他實驗室A樣均未檢出，B、C樣均檢出，檢出比均為67%；總的檢出比為71%。其主要原因是銅綠假單胞菌不穩定，水樣混合不夠均勻。另外，其他實驗對裝置的熟悉程度不同，導致低濃度A樣均未檢出，但B、C樣均檢出，說明裝置的檢出效果較好。

表2 7家實驗室銅綠假單胞菌檢出結果表

3 結論與討論

通過單向負壓吸附取液微孔濾膜過濾裝置與不銹鋼過濾系統對銅綠假單胞菌檢測方法比較，以及單向負壓吸附取液微孔濾膜過濾裝置聯合驗證試驗反饋結果，由此可以說明單向負壓吸附取液微孔濾膜過濾裝置的可行性。聯合驗證最初的試驗設計時7家實驗室最終反饋定量的銅綠假單胞菌檢測結果，未達到預期目的原因分析有以下3點。

（1）母液濃度和穩定性的問題。因銅綠假單胞菌在鹽水中不斷衰減，一直需要驗證，即使一次驗證完成后，濃度已經又發生了變化，只能根據驗證結果，推算出大概濃度，所以無法確保濃度的準確性。溫度、時間、長距離運輸等外在條件對母液的影響，無法準確推算出對銅綠假單胞菌產生的影響，保證不了母液的穩定性，所以導致到達每個實驗室后銅綠假單胞菌數量不一致。

（2）銅綠假單胞菌制樣裝置的問題。裝置存在與實驗室現有抽濾裝置管路不匹配的問題，導致抽濾效果受影響。

（3）水樣的問題，水樣混合及均勻問題。陽性菌加入后，因桶裝純凈水的體積較大（18.9 L），沒有合適的混勻工具，只能靠人工手動盡量顛倒、旋轉進行混勻，不能保證水樣混合均勻，各實驗室間也存在差異。后續可與一些水廠合作，改進過濾裝置的同時，可實現水廠現場快速檢驗銅綠假單胞菌的試驗設想，形成簡單、易操作的相關操作規程。

近幾年，根據監督抽檢和專項抽檢市場上的桶裝水檢測報告發現，微生物衛生指標不合格高于理化指標，其中集中體現在銅綠假單胞菌超標問題上，銅綠假單胞菌已成為桶裝水最突出的質量安全問題。關于銅綠假單胞菌的耐藥性，以及對人體的毒害作用的報道不斷增多，控制桶裝水中銅綠假單菌污染問題已成為每一個桶裝水生產廠家急需解決的問題。通過對榆林市水廠的調研，分析了桶裝水從源頭到成品的每個環節，總結出了導致桶裝水中出現銅綠假單胞菌的原因，主要有4個方面。①生產企業對相關標準理解較少，多數水廠為保證水源的質量，大多建設在市縣周邊的村鎮。企業工作人員食品安全意識淡薄，未進行相關檢驗培訓，對銅綠假單胞菌的檢驗技術了解不夠。②水源污染問題，大部分生產企業多以淺層地下水或地表水為水源，均易受微生物污染。③桶裝水生產過程中管理控制不嚴格，生產環境不符合標準，機器設備設施的維護使用不到位，消毒劑使用劑量控制不合理等。④出廠檢驗執行不到位。桶裝水生產企業除了要加強企業管理意識，還應當重視出廠檢驗的關鍵點控制。

本方法的建立可實現現場快速便捷地制備水質微生物學檢驗樣本，避免敞開式環境污染，減少人員檢測過程中常規操作的工作強度，且解決了水樣檢測過程中傾倒液體、吸附轉移、濾膜過濾中繁雜的人工操作問題，還能夠提高實驗室外環境條件下的檢驗時效和工作效率。一種快速便捷的檢驗桶裝水中銅綠假單胞菌方法的建立，對榆林市桶裝水生產企業的管理控制起到積極監管的作用。待單向負壓吸附取液微孔濾膜過濾裝置實現一次性無菌化生產，通過統一的檢驗操作培訓，每一個水廠都可按批次要求出廠檢驗，及時發現問題，解決問題，才能保證桶裝水的衛生質量，不僅可保障本市人民安全飲水，也可促進桶裝水生產企業的壯大發展。