高效液相色譜法測(cè)量牛奶中山梨酸的過(guò)程優(yōu)化研究

◎ 陳琳琳，王連鳳，王丹慧，李 慧，郭曉梅，孟慶紅

（1.蒙牛乳業(yè)泰安有限責(zé)任公司，山東 泰安 271000；2.內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 011500）

山梨酸又稱為清涼茶酸、2，4-己二烯酸、2-丙烯基丙烯酸，分子式C6H8O2，是一種食品添加劑，對(duì)酵母、霉菌等許多真菌都具有抑制作用，是國(guó)際上應(yīng)用最廣的防腐劑，具有較高的抗菌性能，常被用作食品和藥物制劑的防腐劑，還用于動(dòng)物飼料、藥品、包裝材料等，盡管這些成分的添加對(duì)食物起到了防腐保質(zhì)的作用，但對(duì)人體健康會(huì)造成一定的危害[1]。目前檢測(cè)食品中山梨酸含量的方法是《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測(cè)定》（GB 5009.28—2016），因方法同時(shí)適用于全系食品的苯甲酸和糖精鈉，對(duì)于牛奶山梨酸檢測(cè)回收率雖能符合《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》（GB/T 27404—2008）的要求[2-3]，但較苯甲酸、糖精鈉回收率偏低。我國(guó)對(duì)食品添加劑的檢測(cè)準(zhǔn)確性及速度還有很大的成長(zhǎng)空間，而高效液相色譜法具有分離效率高、快速、準(zhǔn)確可靠、靈敏度高、樣品前處理簡(jiǎn)單等特點(diǎn)[4-6]。本文通過(guò)對(duì)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測(cè)定》（GB 5009.28—2016）前處理和儀器分析步驟進(jìn)行梳理研究，通過(guò)單因子實(shí)驗(yàn)確定高效液色譜法檢測(cè)牛奶中山梨酸的過(guò)程優(yōu)化參數(shù)，優(yōu)化分析操作步驟，提升牛奶中山梨酸檢測(cè)準(zhǔn)確性，減少檢測(cè)操作用時(shí)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

水為GB/T 6682—2008規(guī)定的一級(jí)水。亞鐵氰化鉀 [K4Fe（CN）6·3H2O]、乙酸鋅 [Zn（CH3COO）2·2H2O]、乙酸鉛，分析純；甲醇（CH3OH）、乙酸銨（CH3COONH4），色譜純。山梨酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)。水相微孔濾膜，0.22 μm；塑料離心管50 mL；50 mL容量瓶。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀，配紫外檢測(cè)器；電子天平，感量為0.001 g和0.000 1 g；渦旋振蕩器；離心機(jī)，轉(zhuǎn)速＞ 8 000 r·min-1；超聲波發(fā)生器。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：1 000 mg·L-1；標(biāo)準(zhǔn)中間液 1：200 mg·L-1；標(biāo)準(zhǔn)中間液 2：10 mg·L-1，配制成濃度為 0 mg·L-1、0.2 mg·L-1、0.4 mg·L-1、0.8 mg·L-1、1.0 mg·L-1、2.0 mg·L-1和 3.0 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2 色譜條件

色譜柱C18；流動(dòng)相：甲醇+乙酸銨（20 mmol·L-1），3+97；流速：1 mL·min-1；進(jìn)樣量 10 μL。

1.3.3 樣品沉淀劑優(yōu)化

（1）優(yōu)化前。準(zhǔn)確稱取約2 g（精確到0.001 g）試樣于50 mL具塞離心管中加水25 mL渦旋混勻，50 ℃水浴超聲20 min冷卻后加亞鐵氰化鉀溶液2 mL和乙酸鋅溶液2 mL，混勻，于8 000 r·min-1離心5 min，將水相轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，于殘?jiān)铀?0 mL渦旋混勻后超聲5 min，8 000 r·min-1離心5 min，將水相轉(zhuǎn)移至同一50 mL容量瓶，并用水定容至刻度，混勻，取適量上清液過(guò)0.22 μm濾膜上機(jī)檢測(cè)。

（2）優(yōu)化后。準(zhǔn)確稱取約2 g（精確到0.001 g）試樣于50 mL具塞離心管中加水25 mL渦旋混勻，50 ℃水浴超聲20 min冷卻后加2 mL乙酸鉛（2%），混勻，于8 000 r·min-1離心5 min，將水相轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，于殘?jiān)铀?0 mL渦旋混勻后超聲5 min，8 000 r·min-1離心5 min，將水相轉(zhuǎn)移至同一50 mL容量瓶，并用水定容至刻度，混勻，取適量上清液過(guò)0.22 μm濾膜上機(jī)檢測(cè)。

1.3.4 檢測(cè)器波長(zhǎng)優(yōu)化

山梨酸的最大紫外吸收波長(zhǎng)為254 nm[7]，為獲得最大的靈敏度，在1.3.3優(yōu)化后的方法基礎(chǔ)上，將檢測(cè)波長(zhǎng)從230 nm改變?yōu)?54 nm進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)。

1.3.5 操作流程優(yōu)化

（1）方法1。準(zhǔn)確稱取約2 g（精確到0.001 g）試樣于50 mL具塞離心管中，加水約25 mL，渦旋混勻，于50 ℃水浴超聲20 min，冷卻至室溫后加亞鐵氰化鉀溶液2 mL和乙酸鋅溶液2 mL，混勻，于8 000 r·min-1離心5 min，將水相轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，于殘?jiān)屑铀?0 mL，渦旋混勻后超聲5 min，于8 000 r·min-1離心5 min，將水相轉(zhuǎn)移到同一50 mL容量瓶中，并用水定容至刻度，混勻。取適量上清液過(guò)0.22 μm濾膜，待液相色譜測(cè)定。

（2）方法2。準(zhǔn)確稱取約2 g（精確到0.001 g）試樣于50 mL容量中，加水約25 mL，2%乙酸鉛溶液2 mL，混勻，于50 ℃水浴超聲20 min，冷卻至室溫后用一級(jí)水定容，充分混勻后，然后取部分溶液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，于8 000 r·min-1離心5 min。取適量上清液過(guò)0.22 μm濾膜，待液相色譜測(cè)定。

1.3.6 加標(biāo)方式

采用外加標(biāo)的方法，即吸取一定量的標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到已稱量好的純牛奶中（純牛奶經(jīng)檢測(cè)不含山梨酸），混勻，按試驗(yàn)方法進(jìn)行前處理、上機(jī)檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品沉淀劑優(yōu)化結(jié)果

優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中相關(guān)系數(shù)R2＞0.999 9。通過(guò)表1、表2數(shù)據(jù)分析可以看出，更換沉淀劑前，回收率明顯偏低，更換沉淀劑后，各個(gè)濃度加標(biāo)點(diǎn)的回收率前明顯提升且大于98 %，而且精密度均小于10%。

表1 未改變沉淀劑各加標(biāo)點(diǎn)回收率表

表2 更換沉淀劑后各加標(biāo)點(diǎn)回收率表

2.2 檢測(cè)器波長(zhǎng)優(yōu)化結(jié)果

優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2＞0.999 9。波長(zhǎng)為254 nm時(shí)，通過(guò)表2與表3數(shù)據(jù)比較可以看出，波長(zhǎng)改變后各加標(biāo)點(diǎn)回收率沒(méi)有明顯變化，所以改變波長(zhǎng)對(duì)山梨酸回收率影響不大。

表3 波長(zhǎng)為254 nm時(shí)各加標(biāo)點(diǎn)回收率表

2.3 操作流程優(yōu)化結(jié)果

優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2＞0.999。通過(guò)優(yōu)化前處理操作流程，得出數(shù)據(jù)見(jiàn)表4，通過(guò)表2和表4對(duì)比可以得出，檢測(cè)流程優(yōu)化后，回收率效果略有提升，但提升幅度不大，精密度小于10%；方法1和方法2過(guò)程比較可以看出，方法2更加簡(jiǎn)便易操作，而且避免了前處理煩瑣等容易引入誤差的弊端。

表4 改變流程后各加標(biāo)濃度點(diǎn)回收率表

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測(cè)定》（GB 5009.28—2016）牛奶中山梨酸加標(biāo)檢測(cè)的前處理和儀器分析步驟進(jìn)行梳理研究，并通過(guò)單因子實(shí)驗(yàn)確定過(guò)程優(yōu)化參數(shù)得出使用2%乙酸鉛較亞鐵氰化鉀和乙酸鋅組合作為蛋白沉淀劑時(shí)回收率明顯提高；在230 nm與245 nm波長(zhǎng)條件下檢測(cè)牛奶中山梨酸回收率結(jié)果差異不大；優(yōu)化操作步驟，使前處理更加簡(jiǎn)便易操作，且回收率結(jié)果依然較好，比優(yōu)化前略有提升，但提升幅度不大。所以經(jīng)過(guò)一系列的改進(jìn)優(yōu)化，得出方法2對(duì)提高牛奶中山梨酸回收率的效果更好，而且對(duì)準(zhǔn)確性提高更加有優(yōu)勢(shì)。