復方黃芪口服液聯合化療藥物抗腫瘤效應機制研究*

顧瑛媛 ，普曉佳 ，殷娜 ，萬春平

（1.常州市中醫醫院，常州 213003；2.云南中醫藥大學，昆明 650500；3.云南中醫藥大學第一附屬醫院，昆明 650021）

化療是惡性腫瘤綜合治療的重要手段之一，但是由于化療藥物的毒性及非選擇性，往往對腫瘤患者造成嚴重的毒副作用。復方黃芪口服液是依據孟河醫派學術思想總結出來的治療腫瘤的院內制劑，該制劑主要由黃芪、黃精、人參和陳皮4味藥物組成，具有扶正祛邪、益氣固表和補虛益損等功效。現代藥理研究表明本方具有改善心、腦、腎血液循環及調節免疫功能等藥理作用，臨床被廣泛用于提高腫瘤患者扶正抗邪能力與人體免疫力。復方黃芪口服液已在常州市中醫醫院應用25年余，近3年來治療患者13 000余人次，具有較好的臨床療效，深受廣大患者歡迎。然而迄今為止，復方黃芪口服液的抗腫瘤免疫效應尚未明確，因此有必要進一步深入研究。

機體抗腫瘤免疫的主要方式是細胞免疫，其中T淋巴細胞是最主要的效應細胞。CD4+輔助性T細胞（Th細胞）可分別識別腫瘤細胞內外的抗原肽分子，在一系列輔助信號的參與下，被誘導激活并介導抗腫瘤免疫反應。腫瘤組織中浸潤的Ⅰ型輔助性T細胞（Th1細胞）通過分泌干擾素-γ（IFN-γ）誘導巨噬細胞、CD8+T細胞等浸潤到腫瘤部位，從而對腫瘤細胞產生殺傷作用[1]。調節性T細胞（Treg細胞）在腫瘤組織高表達，具有免疫抑制性，能夠介導腫瘤免疫耐受。本研究以常州市中醫醫院院內制劑復方黃芪口服液為研究對象，以T細胞亞群為切入點，研究復方黃芪口服液聯合化療藥物抗腫瘤的免疫效應及作用機制，以期解釋中醫“正氣”的科學內涵并使復方黃芪口服液更好地應用于臨床。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 BALB/c小鼠，7～8周齡，體質量（20～22）g，雌性，購自遼寧長生生物技術股份有限公司，合格證號：SCXK（遼）2015-0001。上述動物飼養于動物實驗屏障系統，飼養至少1周后開始實驗。溫度（22±1）℃，濕度（55±5）%，12 h光暗循環。飼料和水均在消毒后自由攝取。

1.2 藥物與試劑 復方黃芪口服液由常州市中醫醫院提供。RPMI-1640培養基購自GibcoBRL公司；胎牛血清（FBS）購自Hyclone公司；APC-小鼠白細胞介素-17A（IL-17A）抗體、FITC-小鼠IFN-γ抗體、PE-Cy7小鼠CD4抗體購自美國Biolegend公司；PE-小鼠叉頭樣/翼狀螺旋轉錄因子3（Foxp3）抗體購自 BD PharMingen公司；Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set購自eBioscience公司。

1.3 主要儀器設備 血液分析系統購自日本Sysmex公司；離心機購自德國Thermo Scientific Heraeus公司；3111二氧化碳培養箱購自美國Thermo-fisher公司；流式細胞儀購自美國BD公司。

1.4 細胞株 H22鼠源小鼠細胞購自中國科學院昆明動物研究所。

2 實驗方法與評價

2.1 H22荷瘤小鼠模型的建立、分組和給藥 選取接種8 d的H22鼠源小鼠，腹部皮膚消毒后抽取腹水，離心（1 200 r/min，4℃，5 min，離心半徑 25 cm）后棄上清，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）調整細胞濃度為1×106個/mL，每次于小鼠右側腋部皮下接種0.2 mL，次日將接種的小鼠隨機分為4組，分別為荷瘤模型組、復方黃芪口服液組、環磷酰胺組和聯合用藥組，每組8只。腫瘤接種后第2天開始給藥，環磷酰胺組腹腔注射環磷酰胺（30 mg/kg），復方黃芪口服液組以100 mg/kg劑量灌胃給藥，聯合用藥組在腹腔注射環磷酰胺（30 mg/kg）基礎上灌胃復方黃芪口服液（100 mg/kg）。荷瘤模型組灌胃等體積的生理鹽水。以上各組每日給藥1次，連續16 d。末次給藥24 h后，脫頸椎方式處死小鼠，剝離腫瘤組織，稱取質量并計算腫瘤抑制率。腫瘤抑制率（%）=[（對照組平均腫瘤質量-治療組平均腫瘤質量）÷對照組平均腫瘤質量]×100%。

2.2 脾淋巴細胞的制備 小鼠脫脊椎處死后無菌取其脾臟，將脾臟用玻璃片磨碎，過膜，離心（1200r/min，4℃，5 min，離心半徑25 cm）。棄去上清，沉淀加入紅細胞裂解液（每個脾臟約1mL），混勻，靜置1min，加入 PBS，離心（1 200 r/min，4℃，5 min，離心半徑25 cm）。再加入 PBS，過膜，離心（1 200 r/min，4℃，5 min，離心半徑25 cm）。將所剩細胞洗滌1～2次后，用含10%FBS的RPMI-1640將細胞調至所需濃度。

2.3 脾淋巴細胞增殖功能的檢測 各組脾淋巴細胞接種于 96孔板（4×105個/孔），同時加入 2.5 μg/mL刀豆蛋白A（ConA）進行刺激，細胞于含5% CO2培養箱中培養48 h，四甲基偶氮唑藍（MTT）法測定各組脾淋巴細胞的增殖情況。

2.4 流式細胞術（FACS）檢測 對于細胞內細胞因子染色：分離各組小鼠脾淋巴細胞，與乙酰肉豆蔻佛波酯（PMA）、離子霉素（ionomycin）及布雷菲德菌素A（BFA）于5% CO2培養箱中共培養4 h，結束后收集細胞，冼液洗滌2次，加入免疫球蛋白G（IgG）抗體封閉氟達拉濱+環磷酰胺+利妥昔單抗（FCR），4℃作用10 min以封閉 Fcγ受體（FcγR），FACS洗液洗滌1次后，加入PE-Cy7小鼠CD4抗體，進行表面標志染色。完畢后，固定液中固定，FACS洗液洗滌1次，將細胞懸于穿膜液中，加入抗IL-17A和IFN-γ熒光染料，流式細胞儀檢測分析。對于細胞內特異轉錄因子Foxp3的檢測，無需上述刺激，進行細胞內細胞因子染色，流式細胞儀檢測，flowjo軟件分析。

2.5 統計學分析 數據統計分析采用SPSS 17.0統計軟件包。所有實驗數據以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗或單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 復方黃芪口服液對H22荷瘤小鼠抗腫瘤效應的影響 結果顯示，與荷瘤模型組比較，復方黃芪口服液組、環磷酰胺組、聯合用藥組腫瘤質量較低（P＜0.01）。與環磷酰胺組比較，聯合用藥組腫瘤質量無統計學差異（P＞0.05）。見表1。

表1 復方黃芪口服液對H22荷瘤小鼠抗腫瘤效應的影響（±s）g

表1 復方黃芪口服液對H22荷瘤小鼠抗腫瘤效應的影響（±s）g

注：與荷瘤模型組比較，*P＜0.01。

組別 動物數 劑量（mg/kg） 腫瘤質量荷瘤模型組 8 - 1.38±0.19復方黃芪口服液組 8 100 0.89±0.23*環磷酰胺組 8 30 0.28±0.13*聯合用藥組 8 100（復方黃芪口服液）+30（環磷酰胺）0.26±0.03*

3.2 復方黃芪口服液對H22荷瘤小鼠脾淋巴細胞增殖功能的影響 MTT檢測結果顯示，復發黃芪口服液組、環磷酰胺組、聯合用藥組A值顯著高于荷瘤模型組，差異具有統計學意義（P<0.05或P<0.01）；與環磷酰胺組比較，聯合用藥組A值顯著增加，差異具有統計學意義（P<0.01）。見表2。

表2 復方黃芪口服液對H22荷瘤小鼠淋巴細胞增殖功能的影響（±s）

表2 復方黃芪口服液對H22荷瘤小鼠淋巴細胞增殖功能的影響（±s）

注：與荷瘤模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與環磷酰胺組比較，#P<0.01。

組別 動物數 劑量（mg/kg） A值荷瘤模型組 8 - 0.64±0.02復方黃芪口服液組 8 100 0.87±0.02**環磷酰胺組 8 30 0.48±0.07*聯合用藥組 8 100（復方黃芪口服液）+30（環磷酰胺）0.76±0.08**#

3.3 復方黃芪口服液對H22荷瘤小鼠血常規的影響 藥物干預16 d后眼眶取血進行血常規檢測，結果顯示，與荷瘤模型組小鼠比較，環磷酰胺組小鼠外周血白細胞數、中性粒細胞數降低，差異具有統計學意義（P<0.01）；與環磷酰胺組比較，聯合用藥組白細胞數和中性粒細胞數增加，差異有統計學意義（P<0.05或P<0.01）。見表3。

表3 復方黃芪口服液對H22荷瘤小鼠血常規功能的影響（±s） ×109/L

表3 復方黃芪口服液對H22荷瘤小鼠血常規功能的影響（±s） ×109/L

注：與荷瘤模型組比較，*P<0.01；與環磷酰胺組比較，#P<0.05，##P<0.01。

組別 動物數 劑量（mg/kg） 白細胞數 中性粒細胞數 單核細胞數荷瘤模型組 8 - 6.66±0.29 2.06±0.70 0.38±0.37復方黃芪口服液組 8 100 6.05±1.47 1.45±0.72 0.27±0.14環磷酰胺組 8 30 2.38±0.48* 0.59±0.18* 0.12±0.05聯合用藥組 8 100（復方黃芪口服液）+30（環磷酰胺）3.42±0.32## 0.99±0.29# 0.29±0.23

3.4 復方黃芪口服液對H22荷瘤小鼠脾淋巴細胞Th1細胞表達的影響 FACS檢測結果表明，與荷瘤模型組比較，環磷酰胺組能夠顯著抑制H22荷瘤小鼠 Th1細胞（CD4+IFN-γ+T細胞）比例（P＜0.01）。與環磷酰胺組比較，聯合用藥組Th1細胞比例升高（P<0.05）。見圖 1。

圖1 復方黃芪口服液對H22荷瘤小鼠Th1細胞（IFN-γ）表達的影響（±s，n=8）

3.5 復方黃芪口服液對H22荷瘤小鼠Treg細胞表達的影響 Treg細胞是機體維持自身內環境穩定的主要免疫調節機制。CD4+Foxp3+Treg細胞具有天然的免疫抑制力，在腫瘤發生發展過程中發揮重要作用。FACS檢測結果表明，與荷瘤模型組比較，環磷酰胺組Treg細胞表達水平增加，降低了機體抗腫瘤的免疫反應。與環磷酰胺組比較，聯合用藥組小鼠體內具有免疫抑制作用的CD4+Foxp3+Treg細胞比例下調（P＜0.05），提示復方黃芪口服液聯合環磷酰胺能夠下調Treg細胞比例，進而增強機體抗腫瘤的免疫效應。見圖2。

圖2 復方黃芪口服液對H22荷瘤小鼠Treg細胞表達的影響（±s，n=8）

4 討論

復方黃芪口服液依據孟河醫派學術思想，運用現代制劑工藝，制成口服制劑[2-3]。虛證多指正氣虛弱，現代研究表明虛證患者常表現為細胞免疫功能低下、體液免疫功能紊亂，可見“正氣”是機體免疫能力的一種中醫表達方式[4]。化療是治療腫瘤的一個重要手段，腫瘤化療最常見的問題是化療藥對骨髓干細胞的毒性作用，從而導致白細胞、中性粒細胞數量減少，使治療中斷，腫瘤得不到控制。由化療所致的白細胞減少癥，臨床上表現為頭目昏眩、神疲乏力、面色無華，可歸為中醫虛證。環磷酰胺是常用的腫瘤化療藥物，其應用廣泛，能殺死有絲分裂和進入循環周期的細胞，且無選擇性，對骨髓干細胞產生毒性作用，從而導致白細胞、中性粒細胞數量減少。同時對機體免疫功能具有較強的抑制作用，導致機會性感染[5]。

本研究通過構建H22荷瘤小鼠模型，從抗腫瘤療效、白細胞數、中性粒細胞數、淋巴細胞增殖、T細胞亞群表達等多個層面揭示復方黃芪口服液聯合化療藥物環磷酰胺抗腫瘤的免疫效應及機制，為復方黃芪口服液的進一步研究和臨床推廣奠定理論基礎。結果顯示，與單用環磷酰胺相比，復方黃芪口服液聯合環磷酰胺對腫瘤的抑制效應無顯著影響，然而其能夠顯著增加白細胞數和中性粒細胞數，提高荷瘤小鼠淋巴細胞的增殖功能。

腫瘤免疫治療遵循免疫識別、免疫活化和免疫效應3個基本過程，T淋巴細胞是這一過程中的主要實施者[6]。未致敏的CD4 T細胞經抗原刺激活化后成為CD4+T淋巴細胞，CD4+T淋巴細胞在不同因素作用下，進一步向Th1、Ⅱ型輔助性T細胞（Th2）、Treg細胞等功能性細胞類型分化。Th1類細胞主要分泌 IFN-γ、白細胞介素-2（IL-2）、白細胞介素-12（IL-12），在細胞介導的免疫應答反應中起重要作用[7]。Th2 細胞主要分泌白細胞介素-4（IL-4），主要介導機體的體液免疫反應。Treg細胞主要在胸腺產生，可以誘導免疫耐受，通過分泌細胞因子，包括白細胞介素-10（IL-10）和轉化生長因子-β（TGF-β）發揮免疫負調節作用，是機體維持自身內環境穩定的主要免疫調節機制，這些T淋巴細胞亞群的平衡與抗腫瘤免疫密切相關[8]。FACS檢測結果表明，復方黃芪口服液聯合環磷酰胺能夠提高H22荷瘤小鼠Th1細胞（IFN-γ）比例，下調具有免疫負調控作用的Treg細胞比例，提示復方黃芪口服液可能通過促進Th1的激活，下調Treg細胞介導的免疫負調控機制，從而增強抗腫瘤免疫效應。