玉米氮狀況相關生物標記物的篩選和應用

石習，寧麗華，葛敏，鄔奇，趙涵

玉米氮狀況相關生物標記物的篩選和應用

石習1,2，寧麗華2，葛敏2，鄔奇2，趙涵1,2*

1南京農業大學農學院，南京 210014；2江蘇省農業科學院種質資源與生物技術研究所/農業生物學省級重點實驗室，南京 210014

【背景】RNA表達豐度作為一種生物標記物已廣泛應用于臨床診斷階段，但在農業栽培中診斷作物營養狀況的應用較少。【目的】挖掘和驗證轉錄水平上可以作為生物標記物精確指示玉米氮營養狀況的基因，指導精準施用氮肥。【方法】基于不同氮素處理的基因芯片和RNA-Seq數據，通過生物信息學和統計學方法初步篩選出基因表達豐度高度響應氮素處理的生物標記物候選基因；利用不同基因型、不同氮處理的玉米材料，通過熒光定量PCR方法和凱氏定氮法，進一步篩選氮響應生物標記物基因；并構建預測玉米氮狀況的廣義線性模型，準確指示玉米氮營養狀況。【結果】首先初步篩選出10個表達水平較高的基因，且mRNA表達豐度高度響應氮素處理的生物標記物候選基因；利用不同氮素條件下種植的B73材料從10個候選基因中進一步篩選出8個在充足氮、限制氮處理后基因表達豐度存在顯著差異的基因；隨后選取遺傳多樣性豐富、生態區域廣泛的26種自交系材料和4種雜交種材料進一步篩選，發現有4個基因表達獨立于基因型，可以在不同基因型玉米材料中穩定表達；并且通過相關性分析發現，在充足氮和限制氮處理下，這4個基因表達豐度差異與穗位葉總氮含量差異具有顯著相關性（2均大于0.6），表明這4個基因可以作為氮響應生物標記物進行實際應用；將4個氮響應生物標記物基因分別組合構建兩基因、三基因、四基因線性模型，由（2）、（3）和（4）這三個基因構建的線性模型用于預測玉米植株氮狀況的應用性最強，其函數關系為=1.143+0.0172－0.3023+0.0174；選取大田種植的6個雜交種材料對三基因模型預測功能進行驗證，結果表明，三基因模型能夠在大田環境中準確診斷玉米植株氮素營養狀況。【結論】獲得4個高度響應玉米氮狀況的生物標記物基因，構建的三基因模型可以準確預測玉米氮素營養狀況。該生物標記物的開發可以有效實時監測玉米植株氮狀態，優化氮肥使用，從而實現成本最低時農作物產量的最大化。

玉米；生物標記物；氮素；穗位葉；總氮測定；廣義線性模型

0 引言

【研究意義】玉米是中國重要的糧飼作物，其生長過程中對氮肥需求量極大。在農業生產中，為了獲得更高的玉米產量，農民不斷施用化肥[1]。此外，農民通常采用‘一炮轟’式施肥方式，即一次性投入大量肥料，不再追肥，這種施肥方式并未遵循玉米對氮肥需求的階段性規律。研究表明，近年來，中國化肥投入和糧食產出極不相稱，化肥施用量的增速遠遠超過糧食產量的增速，氮肥利用率直線下降[2]。過量施用氮肥并不能保證產量的持續增加，反而導致玉米品質下降、農民生產成本增加等問題，另外過量施用氮肥還會造成農田土壤大面積酸化[3]、水體富營養化、大量氮沉降[4]等環境問題。這些問題持續威脅著人類的健康和福祉。所以，如何科學施用氮肥、提高玉米氮肥利用率成為研究人員重點關注的問題。利用氮響應RNA生物標記物精確指示玉米氮素營養狀況，指導農業工作者依據植株需求科學施用氮肥，對提高作物氮肥利用率，降低生產成本，減少氮肥施用對生態環境造成的污染等具有重要意義。【前人研究進展】精準施氮的管理決策取決于對作物氮素營養狀況和土壤養分豐缺的精確評價。作物氮素營養狀況診斷的方法有多種，但這些方法都存在一定的局限性。葉色、生長形態等作物外部形態診斷法[5]以其簡單易行的優點，被廣大農民廣泛采用。但是該方法具有嚴重滯后性，不適合應用于農業生產，當農民觀察到明顯的缺氮現象時，作物的產量和品質已經受到嚴重影響。凱氏定氮法[6]是一種常用的化學方法，是國家及行業內對于植物全氮測定的標準方法，該方法結果準確，但是需要經過取樣、清洗、殺青、烘干、研磨、稱重、實驗室分析等多道處理[7]，試驗操作繁瑣耗時、破壞性強、危險性大，不能用于高通量測定。SPAD-502?ChlorophyⅡ Meter2作為一種無損、快速的診斷方法，被廣泛應用于棉花[8]、水稻[9]、小麥[10]、玉米[11]、大麥[12]等多種作物氮素狀況的測定領域。但是方法受到一些因素的限制，如葉位和基因型[13]，同一材料的重復性較差，因此，需要多次測量取平均值作為其測定結果。光照能引起葉綠體的運動，測定SPAD值前光照強度的變化可能會改變同一份樣品的測定結果[14]。以上方法存在諸多局限性，需要不斷開發一些新的、可靠的診斷方法來準確、穩定、實時地診斷作物氮素營養狀況，滿足高通量測定的要求。轉錄組包含了生物體如何與環境相互作用的豐富信息，記錄了基因表達隨環境變化的變化。來自不同病毒和細菌感染的血液轉錄組顯示，宿主對病毒和細菌感染的反應是不同的[15]。以這些差異表達的基因為出發點，在RNA水平上開發敏感、特異的基因表達生物標志物，以準確區分病毒性和細菌性感染，為臨床診斷提供依據。目前RNA生物標記物已廣泛應用于臨床診斷領域，在農業栽培領域應用還較少，但也有成功應用。GWENAELLE等[16]以向日葵作為試驗材料研究植物對干旱脅迫的轉錄反應，開發出3個與植物水分狀況高度相關的基因，其表達獨立于4個測試基因型和植物階段（開花前和開花后）。Kenkel等[17]發現生物標記物基因表達變化的大小與熱應激壓力強度呈正比，可以通過基因表達生物標記物量化熱脅迫珊瑚礁受損嚴重程度。【本研究切入點】RNA生物標記物能夠動態反映細胞狀態和調控過程，其表達水平相比DNA可以提供更多調控信息，比蛋白質生物標記物更加靈敏，在醫學領域應用價值極高。但在農業栽培領域應用還較少，缺乏RNA生物標記物基因指示作物氮素營養狀況的研究。玉米缺氮會嚴重影響玉米產量與品質，深入研究一組可以靈敏診斷玉米植株氮狀況的RNA生物標記物基因，可以有效指示玉米精確施肥。【擬解決的關鍵問題】本研究利用不同氮素處理的基因芯片和RNA-Seq數據鑒定出一組高度響應玉米氮狀況的生物標記物候選基因，通過熒光定量PCR的方法篩選出4個穩定表達且獨立于材料基因型的基因，建立了指示玉米植株氮營養狀況的診斷模型，并進行了田間驗證。氮響應RNA生物標記物可以作為有效的農藝工具實時監測田間玉米植株的氮狀況，精確指示農業工作者依據植株需求科學施肥，從而達到按需施肥、玉米高產高效的目的。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

溫室試驗：所用供試玉米（L.）品種為No.1—No.31，共31種玉米材料（電子附表1），其中，B73材料設置10組生物學重復，其他材料各設置3組生物學重復。于2020年5月至7月在江蘇省農業科學院進行溫室試驗，玉米籽粒采用全營養土穴盤播種，三葉期（V3階段）移栽于45 cm×30 cm×50 cm盆內。盆栽試驗采用限制施氮量（全氮含量為0.7 g·kg-1）的大田土壤，連續5年未施用氮肥，pH為6.1—6.8。以0.4 g·kg-1氮肥（尿素）、0.12 g·kg-1磷肥（P2O5）和0.08 g·kg-1鉀肥（K2O）為基肥。待植株生長至六葉期（V6階段）時進行追肥處理，共設置2組氮素處理，追施0.6 g·kg-1尿素的充足氮處理（N1）和不增施氮肥的限制氮處理（N0）。

大田試驗：所用供試玉米品種為No.32—No.37，共6種玉米雜交種材料（電子附表1），各設置10組生物學重復。于2021年5月至8月在江蘇省農業科學院六合基地高低氮池中種植，玉米籽粒采用全營養土穴盤播種，V3期移栽到大田高氮池（sufficient nitrogen，SN）、低氮池（deficient nitrogen，DN）中。高氮池土壤全氮量為1.348 g·kg-1，低氮池土壤在每年種植玉米之前用水浸泡后攪拌機充分攪拌，以保證土壤養分均勻，土壤全氮量為0.798 g·kg-1。

1.2 氮響應生物標記物候選基因的初步篩選

從NCBI網站上下載獲得（GSE32361[18]）初步篩選氮響應生物標記物候選基因所使用的數據，該數據包括不同氮素處理下玉米材料DNA的基因芯片數據。（1）首先通過Microsoft Excel 2010對該數據進行簡單數據過濾處理，將下載獲得的強度值求導以2為底的對數值，并以Log2強度值＞9.0為標準，篩選出基因表達強度較高的探針集；對同一探針充足氮處理與限制氮處理下的基因表達強度值進行檢驗分析，以＜0.01作為顯著差異標準，篩選出高度響應不同氮素處理的探針集；計算充足氮、限制氮處理下基因表達強度值差異倍數，并以基因表達強度值至少相差10倍為標準，進一步篩選出積極響應不同氮素處理的探針集。（2）將數據過濾獲得的探針序列分別比對到B73基因組上，獲得每條探針對應基因ID，去除重復基因；（3）對葛敏等[19]在足氮和低氮處理下B73材料基因表達RNA-Seq數據進行同樣數據過濾，將芯片數據與RNA-Seq數據結果疊加，取在2組數據中基因表達水平均較高且充足氮、限制氮處理下基因表達差異顯著的基因；（4）通過MAIZE GDB網站獲得這些候選基因信息，根據基因在玉米植株各部位表達情況，篩選出在葉片中穩定表達的候選基因；作為氮響應生物標記物候選基因進行熒光定量PCR驗證。

1.3 樣品處理

在玉米生長至十二葉期（V12階段）收集樣品，共37個玉米品種，溫室試驗中B73材料有10組生物學重復，其他品種各3組生物學重復，大田試驗中各玉米材料有10組生物學重復，取1/2片穗位葉樣品，液氮研磨至粉末狀，取1/4葉片粉末立刻凍存于-80℃備用，后續用于穗位葉RNA提取試驗；其他3/4葉片粉末于105℃烘箱殺青30 min，再于65℃烘至恒重，過60目細篩，備用，后續用于凱氏定氮法葉片總氮含量測定試驗。

1.4 葉片總氮含量的測定

玉米穗位葉組織樣品按上述方法處理，稱取處理后的樣品0.05 g，用凱氏定氮法測定葉片總氮，記錄滴定體積。利用以下公式計算葉片總氮含量：

全氮量（mg·g-1）=（V－V0）×c（1/2HCl）×14.0×10-3/m

式中，V：滴定試液時所用酸標準溶液的體積（L）；V0：滴定空白時所用酸標準溶液的體積（L）；c：0.01 mol·L-1（1/2HCl）標準溶液濃度；m：烘干葉片粉末的質量（g）。

1.5 氮響應生物標記物候選基因表達測定

提取粉末。使用Invitrogen TRIzol試劑（ThermoFisher公司）提取穗位葉RNA。使用PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒（TaKaRa公司）進行反轉錄反應，使用ChamQTMSYBR? qPCR Master Mix試劑盒（TaKaRa公司）進行qRT-PCR試驗，按照試劑盒說明配制qRT-PCR反應混合液，使用7900 HT TagMan machine儀器（Applied Biosystems公司）按照兩步法進行60°C退火溫度和40個PCR循環的qRT-PCR反應。本研究所使用的引物如表1所示，其中NM11為內參引物，基因號為。

表1 本研究所用的引物序列

1.6 數據統計及分析

采用Microsoft Excel 2010對同一玉米材料在N0、N1 2種氮素處理下4個氮響應生物標記物基因表達豐度差異（N1﹕N0）與植株穗位葉總氮含量差異（N1﹕N0）進行相關性分析。以2＞0.6，＜0.01作為顯著相關標準。

采用SPSS 20.0軟件線性回歸分析進行兩基因、三基因、四基因廣義線性模型的構建。

2 結果

2.1 初步篩選出10個氮響應生物標記物候選基因

采用多個數據過濾和處理步驟初步篩選氮響應生物標記物候選基因（表2）。首先進行數據過濾，以Log2強度值＞9.0為標準，從84 246條探針中篩選出基因表達水平較高的11 891條探針；通過檢驗，以＜0.01作為顯著差異標準，篩選出6 632條充足氮處理與限制氮處理基因表達水平差異顯著的探針；以充足氮、限制氮處理下基因表達強度值至少相差10倍為標準，進一步篩選出69條探針。將這些探針與B73基因組比對，獲得基因ID，這69條探針分別代表63個不同基因；利用葛敏等[19]在足氮和低氮處理下B73材料基因表達RNA-Seq數據進行同樣數據過濾，將芯片數據與RNA-Seq數據結果疊加，篩選出25個在2組數據中基因表達水平均較高且充足氮、限制氮處理后基因表達差異顯著的基因；通過MAIZE GDB網站獲得這些基因在玉米植株各部位表達情況，有10個基因在葉片中穩定表達且表達水平較高；將這10個基因作為生物標記物候選基因，進一步通過熒光定量PCR試驗進行篩選。

2.2 篩選出8個候選基因高度響應氮素處理

為了驗證這10個生物標記物候選基因在玉米穗位葉中高度響應氮素處理，選取玉米品種B73作為試驗材料，進行充足氮（N1）、限制氮（N0）處理（圖1-A和圖1-B），在N1、N0處理下，B73材料表現出明顯的表型差異，植株生長形態高度響應氮素處理，B73是一種氮敏感玉米材料。

表2 氮響應生物標記物候選基因的初步篩選

A、B：N1、N0氮素處理下B73株型差異；C：N1、N0氮素處理下B73總氮含量差異；D：N1、N0氮素處理下10個候選基因的表達情況

利用凱氏定氮法對B73材料穗位葉總氮含量進行測定，如圖1-C所示，充足氮（N1）處理下葉片總氮量平均為24 mg·g-1，限制氮（N0）處理下葉片總氮量平均為17.5 mg·g-1，穗位葉總氮含量差異顯著，充足氮處理B73總氮含量顯著高于限制氮處理。

利用熒光定量PCR方法對10個生物標記物候選基因在玉米穗位葉中基因表達豐度變化進行檢測（圖1-D），在2種氮素（N1、N0）處理下，NM01、NM05基因表達豐度變化不顯著，其他基因表達豐度變化均差異顯著，并且在10組生物學重復B73材料中可以穩定表達。在N0處理后，NM02、NM03、NM07、NM08、NM09基因表達量下調，NM04、NM06、NM10基因表達量上調。根據以上結果篩選出8個基因在充足氮（N1）、限制氮（N0）處理下表達差異顯著，并且可以穩定表達的生物標記物候選基因。

2.3 篩選出4個候選基因表達獨立于基因型

為了確定這8個候選基因的表達是否獨立于基因型，選取遺傳多樣性豐富、生態區域廣泛的26種自交系材料和4種雜交種材料（電子附表1，材料No.2—No.31），進行相同充足氮（N1）、限制氮（N0）處理，進一步篩選這8個候選基因。V12階段收集穗位葉進行RNA提取和熒光定量PCR試驗（圖2），在N1、N0處理后，（NM02）、（NM03）、（NM06）、（NM07）至少在25種材料中存在基因表達顯著差異，與在B73材料中表達模式一致（圖1-D，表3）。其他4個基因在30種供試材料中出現多種材料表達模式不一致，具有基因型依賴性。綜上所述，進一步篩選出4個氮響應生物標記物候選基因，其基因表達獨立于基因型，可以在不同基因型玉米材料中穩定表達（表3）。

*：P＜0.05；**：P＜0.01。下同 *: P＜0.05; **: P＜0.01. The same as below

2.4 篩選的4個基因可以準確指示玉米氮營養狀況

為了研究這4個候選基因的表達豐度能否準確指示玉米氮營養狀況，利用凱氏定氮法對穗位葉實際總氮含量進行測定（圖3-A），No.2—No.21、No.28— No.31材料在充足氮（N1）環境下穗位葉總氮含量顯著高于限制氮（N0）環境，其他No.22—No.27材料的穗位葉總氮含量在N1和N0氮處理后差異不顯著。

A：凱氏定氮法穗位葉總氮測定；B—E：NM02、NM03、NM06、NM07基因表達豐度變化與總氮含量變化的相關性分析

表3 4個生物標記物候選基因

為了確定在N1和N0處理后穗位葉實際總氮含量變化與生物標記物候選基因表達豐度變化是否具有相關性，對二者進行相關性分析（圖3-B—圖3-E），N1、N0處理后穗位葉總氮含量變化與生物標記物候選基因表達豐度變化均具有顯著相關性，2為0.63—0.67，相關性模型多以乘冪和多項式為最佳。其中，NM02、NM03、NM07基因的表達豐度變化與總氮含量變化呈正相關，NM06基因呈負相關。相關性分析結果表明，這4個基因能夠準確反映玉米植株氮素營養狀況，且基因表達獨立于基因型，可以作為氮響應生物標記物基因進行實際應用。

2.5 三基因模型預測玉米氮狀況結果最佳

為了促進生物標志物的實際應用，利用NM02、NM03、NM06、NM07這4個氮響應生物標記物基因構建了兩基因、三基因、四基因模型，用于預測玉米氮素狀況。利用qRT-PCR試驗數據和總氮含量數據構建模型，以鄭58為對照材料，與其他材料進行比較（Fold difference=鄭58/其他材料）。如圖4所示，以鄭58與其他材料的生物標記物基因表達差異比值為值（NM02（1）、NM03（2）、NM06（3）、NM07（4）），實際氮含量差異比值為值，利用SPSS2.0軟件線性回歸分析方法進行模型構建，分別獲得兩基因、三基因、四基因廣義線性模型。

在兩基因模型中，NM06（3）和NM07（4）構建的線性模型相關性最高，2為0.51。在三基因模型中，NM03（2）、NM06（3）和NM07（4）這三個基因構建的線性模型相關性最高，2為0.53。四基因模型與三基因模型相關性基本一致，均高于兩基因模型。基于預測效果與測試成本考慮，三基因模型可以作為玉米氮素狀況的最佳預測模型，應用于診斷玉米氮營養狀況。兩基因模型、三基因模型、四基因模型預測模型如圖4所示，函數關系如表4所示。

2.6 三基因模型的實際應用

為了驗證三基因模型是否可以有效應用到實際生產中，在V12階段采集大田種植的6個雜交種材料穗位葉，通過熒光定量PCR試驗，獲得NM03、NM06、NM07 3個基因在轉錄水平的表達豐度，根據=1.143+0.0172－0.3023+0.0174函數關系，計算出值，=充足氮環境下鄭58總氮含量/預測材料總氮含量，其中，鄭58材料在充足氮環境下實際測得總氮含量為24.5 mg·g-1，限制氮環境下為18.7 mg·g-1（圖3-A），可以計算出大田試驗材料的預測氮含量（圖5）。在高氮池（SN）中種植的材料預測穗位葉氮含量平均值在26.1 mg·kg-1，最小值在22.1 mg·kg-1，在低氮池（DN）中種植的材料預測穗位葉氮含量平均值在14.7 mg·kg-1，最大值在18.2 mg·kg-1。在大田高氮池（SN）和低氮池（DN）中種植的同一材料，穗位葉預測氮含量差異顯著。以上結果表明，三基因模型可以準確預測出大田環境中玉米材料的氮狀況，可以有效應用到實際生產中。

表4 模型函數關系

A：兩基因模型；B：三基因模型；C：四基因模型

A: The two-genes model; B: The three-genes model; C: The four-genes model

圖4 廣義線性模型

Fig. 4 The generalized linear model

圖5 三基因模型預測的氮含量結果

3 討論

3.1 RNA生物標記物的廣泛應用

RNA分子作為生物標記物廣泛應用于疾病診斷、治療及預后監測等方面[20]，其表達水平相比DNA可以提供更多調控信息，比蛋白質生物標記物更加靈敏，特異性更高，在醫學領域應用價值極高。RNA生物標記物在生物體受到外界環境脅迫早期，細胞內一些響應該脅迫的基因在RNA水平產生異常變化信號，為機體提前預警，由于RNA生物標記物的靈敏性和預警性，在醫學上備受關注，并且該方法取樣小，對受試生物危害小，也是生物標記物在醫學領域研究中的一大優勢[21]。雖然RNA生物標記物應用于植物領域檢測農藝性狀的研究還較少，但該方法的優勢在植物領域同樣存在。本研究以玉米為模型，通過挖掘轉錄水平上可以作為生物標記高度響應不同氮素處理的基因，開發出一套RNA生物標記物，精確指示田間玉米氮素營養狀況，從而可以指導玉米農業生產中科學施氮，獲得更高的玉米產量和品質。

3.2 施氮充足對玉米產量與品質的重要性

本研究中采集V12階段穗位葉進行生物標記物候選基因的篩選，V12階段玉米植株處于大喇叭口期（V11—V12），營養生長和生殖生長同時進行，葉片、莖節等營養器官旺盛生長、雌雄穗等生殖器官強烈分化與形成[22]。此時期是玉米一生中生長發育最旺盛的階段，也是田間管理最重要的階段，要保證玉米施肥充足。邊大紅等[23]結合前人研究發現采用播種或苗期少量施氮，大喇叭口期重施氮肥的分次施氮方式有利于促進夏玉米莖稈和雌穗發育。周琦等[24]分別在拔節期、大喇叭口期、吐絲期追加氮肥，發現在大喇叭口期追肥產量差異最為顯著。常程等[25]研究發現，在大喇叭口期追施氮肥，有利于促進花前干物質積累，增大花后籽粒體積、粒數和粒重，從而獲得高產。因此，從實際生產考慮，在進行生物標記物候選基因篩選時，選擇V12階段作為取樣節點，如果檢測結果發現植株缺氮，可及時追肥，避免對籽粒產量和品質產生影響，以達到最好的應用效果。

本研究在確定4個氮響應生物標記物基因的表達豐度能否準確指示玉米氮營養狀況中，選擇玉米穗位葉總氮量作為植株氮營養狀況的評估標準。前人研究發現玉米穗位葉氮含量與玉米產量之間呈顯著正相關。碳、氮代謝是植物體內最主要的兩大代謝過程，這兩個過程相互聯系又相互制約，碳代謝為氮代謝提供碳源和能量，氮代謝為碳代謝提供酶和光合色素，二者又共同競爭光反應生成的同化力、ATP和碳骨架[26]等。葉片是植物進行光合作用的主要器官，穗位葉碳的同化物是玉米籽粒形成及其物質基礎主要來源[27]，穗位葉缺乏充足的氮素供應，會導致葉片葉綠素含量降低，光合效率下降，光合產物累積減少，從而導致玉米產量和品質下降[28-29]。本研究將穗位葉總氮量作為玉米氮素營養狀態評估標準，旨在通過氮含量評估葉片氮代謝是否可以為碳代謝提供充足的酶和光合色素，滿足籽粒淀粉積累的需要。并且用于篩選的生物標記物基因的樣品也取自穗位葉，與穗位葉氮含量測定樣品是同一份，相關性更強，從而通過生物標記物基因表達豐度預測植株氮狀況是否可以滿足籽粒灌漿和干物質積累的需要。

3.3 氮響應生物標記物基因表達的獨立性

通過生物信息學和熒光定量PCR試驗篩選出4個氮響應生物標記物基因，其中（NM03）編碼多胺氧化酶1，在節間、葉片、根等組織及萌發過程中表達，多胺是植物生長或適應環境變化所必需的。多胺氧化酶1負責將精胺和熱精胺反向轉化為亞精胺[30]，調節激素信號，從而參與到對生物或非生物脅迫的防御反應。（NM06）編碼一個MYB轉錄因子，在節間、胚、葉片中表達。MYB蛋白家族龐大，功能多樣，大部分MYB家族蛋白作為轉錄因子發揮作用，是植物發育、代謝、防御生物和非生物脅迫過程中的關鍵調控因子[31]。編碼營養貯藏蛋白2，主要在籽粒、分生組織、葉片和根中表達，儲藏蛋白為幼苗早期發育提供營養物質，并參與到植物吸收、轉運和再利用養分等過程[32]。（NM02）編碼一個KNOTTED INDUCED1蛋白，該基因在葉片和雌穗花絲中表達，該基因發生隱性突變后會導致玉米莖稈分枝能力的缺失和多余雌穗的產生[33]。這4個氮響應生物標記物基因，、參與防御非生物脅迫反應，參與養分吸收、轉運。這些基因的功能可能部分反應低氮脅迫處理會對這些基因表達產生重要影響。這些基因在葉片中表達量豐富，并且積極響應氮素處理，靈敏度高，其RNA表達豐度可以作為生物標記物，精確指示玉米氮素營養狀況。

本研究在進行氮響應生物標記物開發與挖掘過程中，涉及玉米品種范圍廣，包括27個自交系材料和10個雜交種材料，這些材料主要包括氮敏感型材料和少部分氮鈍感型材料。在充足氮（N1）、限制氮（N0）處理后，編號No.1—No.21材料葉片總氮含量表現出顯著差異，包括B73、鄭58等，這些材料是氮敏感型材料，編號No.22—No.27材料（Mo17、昌7-2、DH392、PH4CV、L239、D1798Z）葉片總氮含量變化小且差異不顯著，這些材料比較耐低氮，是氮鈍感材料。雜交種材料大多是氮敏感型材料，喜氮，在一定施氮范圍內，玉米產量隨施氮量增加而增加。例如B73材料是氮敏感型材料，Mo17是氮鈍感型材料[19]，其雜交種BM對氮素比較敏感，育種家在選育雜交種材料時，考慮到生產實際，傾向于選育喜氮雜交種材料。氮敏感型玉米品種在低氮環境中產量很差，當處于充足氮環境中，產量大幅度提高，產量受氮肥施用影響很大，而耐低氮型玉米材料在低氮環境下產量較高，當提供充足氮肥時，產量不會發生顯著變化[34-35]，氮敏感型品種和耐低氮品種氮利用效率不同。對于這一現象，本研究認為耐低氮型材料可能在低氮脅迫下產生應激反應，導致植物體努力吸收土壤中的氮素。不管是氮敏感型材料，還是氮鈍感型材料，本研究中篩選得到的氮響應RNA生物標記物基因，其表達情況可以準確反映這些材料的氮狀況，31種氮敏感型材料在N1、N0處理后基因表達差異顯著，而6種耐低氮型材料，基因表達差異不顯著。

3.4 應用潛力

利用這4個氮響應生物標記物基因構建的預測模型，以三基因模型最佳，可以精確指示玉米植株氮素營養狀況，應用到大田實際生產中。與傳統方法相比，篩選獲得的4個基因高度響應氮素處理，靈敏度極高，在限制氮處理轉充足氮處理僅2 h，生物標記物基因復合表達值已出現明顯變化，15和26 h變化更加明顯[18]。在植物尚未表現出缺氮表型時，在轉錄水平提前檢測到缺氮信號，及時補充氮源，避免了長期缺氮對玉米籽粒品質和產量產生影響；方法準確度高，將N1和N0處理下生物標記物基因表達豐度差異與凱氏定氮法實際測得總氮含量差異與進行相關性分析，相關顯著（2均大于0.6）；試驗流程簡單，試劑無腐蝕性，安全性高；該方法僅取少量穗位葉提取RNA進行檢測，對穗位葉損傷小，不會影響玉米籽粒的干物質積累和正常灌漿；此外，該方法主要通過熒光定量PCR方法對植株氮狀況進行檢測，結果穩定，生物學重復性好，且生物標記物基因表達獨立于品種基因型，不受品種材料限制。因此，利用RNA生物標記物基因預測玉米植株氮素營養狀況具有較強應用價值。本研究仍存在一些需要繼續完善的地方，從生產實際考慮，對V12階段葉片進行生物標記物基因表達情況的測定，缺乏對不同發育階段全面測定生物標記物基因表達情況。

4 結論

開發出4個可以穩定反映玉米植株氮狀況的RNA生物標記物基因，其表達獨立于基因型；構建的三基因廣義線性模型可以準確預測玉米植株氮狀況，指導生產實踐中科學施氮。

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Screening and Application of Biomarkers Related to Maize Nitrogen Status

SHI Xi1,2, NING LiHua2, GE Min2, WU Qi2, ZHAO Han1,2*

1College of Agriculture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210014;2Institute of Crop Germplasm and Biotechnology, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Provincial Key Laboratory of Agrobiology, Nanjing 210014

【Background】The transcriptional levels of selected genes, referred as biomarkers, have been widely applied in clinical diagnosis processes. They were yet rarely used in agricultural cultivation for determining the nutrient statues in maize. 【Objective】This study aims to explore the genes that can be used as biomarkers to reflect the nitrogen abundance in maize, so as to help the precise application of nitrogen fertilizer. 【Method】Based on the data of gene chip and RNA-Seq under different nitrogen treatments, we chose the genes with high transcriptional abundance in response to N fluctuation as candidates. These genes were further screened by qRT-PCR and Kjeldahl methods using maize materials with different genotypes under different nitrogen treatments. The generalized linear models for predicting nitrogen status were constructed to accurately indicate the nitrogen nutrition status of maize. 【Result】Firstly, we selected ten candidate genes with high expression level that are responsible for N fluctuation. Secondly, we found eight candidate genes that are differentially expressed under N treatment; Next, twenty-seven inbred and four hybrid lines covering a rich array of genetic diversity were selected to screen the candidate genes, and found that four genes stably expressed in different genotypes of maize. The expression abundance difference of these four genes were significantly correlated with total nitrogen content in panicle leaves through correlation analysis (2was greater than 0.6) with sufficient nitrogen and limited nitrogen treatment in thirty materials. According to the above results, these four genes can be used as nitrogen response biomarkers to indicate maize nitrogen status. The two-genes, three-genes and four-genes models were constructed by these four biomarker genes for predicting nitrogen status. The three-genes model was composed of(2),(3) and(4) were the most useful model for predicting the nitrogen status of maize plants, and the functional relationship was=1.143+0.0172-0.3023+0.0174.Finally, the prediction function of the three-genes model was verified with six hybrids planted in the field. The results show that the three-genes model can accurately diagnose the nitrogen nutrition status of maize planted in the field environment. 【Conclusion】We explored and verified four biomarker genes highly responsive to maize nitrogen status. The three-genes model works best in predicting the maize nitrogen nutrition status. The development of the biomarker can effectively and real-timely monitor the nitrogen status of maize plants, thus is helpful for optimizing the use of nitrogen fertilizer, thereby maximize the crop yield at the lowest cost.

; biomarker; nitrogen; panicle leaf; determination of total nitrogen; generalized linear models

2021-07-30；

2021-10-18

國家自然科學基金（32001564）、江蘇省農業生物學重點實驗室重大自主研究課題（JKLA2021-ZD0）

石習，Tel：13813928391；E-mail：nancy1448374364@163.com。通信作者趙涵，Tel：15062206158；E-mail：zhaohan@jaas.ac.cn

（責任編輯 李莉）