重組Fc融合蛋白類藥物研究進展

孫鈺芳，宗 輝，郭詩雨，陳思敏，安毛毛*，慎 慧

1. 同濟大學附屬第十人民醫院藥學部，上海 200072

2. 同濟大學附屬東方醫院南院檢驗科，上海 200120

近年來，治療性單克隆抗體是最暢銷的生物制劑。然而，隨著基因工程、蛋白質工程等技術的成熟，新型抗體衍生物正在取代傳統的單克隆抗體，用于解決復雜的病理生理學問題并改善現有療法［1］。IgG形式的抗體分子之所以在體內具有長半衰期，主要歸因于其Fc片段與新生兒Fc受體（neonatal Fc receptor， FcRn）結合介導的再循環機制。通過重組表達技術將IgG-Fc片段連接到另一個具有生物學活性的分子上，所開發的藥物稱為重組Fc融合蛋白類藥物。IgG-Fc片段融合蛋白技術是目前延長蛋白和多肽類藥物半衰期的最有效手段之一。Fc融合蛋白分子由免疫球蛋白的Fc結構域（鉸鏈區-CH2-CH3）與功能分子連接構成。細胞表面受體、細胞因子、酶、病原體表面肽類抗原等具有生物學意義的分子都可以與Fc段進行融合表達［2］，從而延長其體內半衰期，達到藥效學作用［3］。此外，Fc融合蛋白還具有抗體的其他生物學特性，如引發抗體依賴細胞介導的細胞毒性（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity， ADCC）效應。

1989年，Capon等［4］將CD4分子細胞外結構域與人IgG1-Fc融合，構建了第1個治療性Fc融合蛋白，該蛋白與人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus， HIV）的包膜（Env）糖蛋白特異性結合，抑制HIV感染CD4＋T細胞。近年來，Fc融合蛋白類藥物快速發展。本文對重組Fc融合蛋白的結構特征與藥理學特性進行綜述，并介紹重組Fc融合蛋白的臨床藥物開發及其在非臨床領域中的應用與發展。

1 重組Fc融合蛋白的藥理學作用機制

Fc融合蛋白由功能蛋白和Fc段構成，其藥理學特性機制主要分為2類：（1）功能蛋白識別腫瘤細胞表面抗原，Fc段與FcγRs作用激活免疫細胞，誘導ADCC、抗體依賴的細胞吞噬（antibodydependent cellular phagocytosis，ADCP）和補體依賴的細胞毒性（complement-dependent cytotoxicity， CDC）效應，產生溶細胞作用；（2）僅功能蛋白發揮其特定的生物學作用，Fc段輔助延長功能蛋白半衰期，使其在體內長效作用。

1.1 Fc段的主要功能

1.1.1 介導細胞毒性效應Fc段的潛在免疫調節功能依賴其與FcγRs家族的相互作用來激活或抑制免疫細胞，介導ADCC、CDC及ADCP效應，近而調控后續的免疫反應。許多靶向腫瘤細胞表面抗原的治療性單克隆抗體依賴此機制發揮作用，如利妥昔單抗、曲妥珠單抗、阿侖單抗等。細胞表面蛋白的配體與Fc段構建而成的融合蛋白同樣也可依賴Fc-FcγRs的相互作用發揮溶細胞作用。溶細胞性Fc融合蛋白的功能蛋白識別靶細胞表面抗原，Fc段與自然殺傷（natural killer， NK）細胞表面的FcγRⅢA結合，激活NK細胞，釋放細胞毒性顆粒（穿孔素、顆粒酶），導致靶細胞凋亡［5］。增強Fc段與FcγRⅢA的親和力可改善ADCC效應介導的腫瘤殺傷作用。補體復合物C1的亞組份C1q是由6個相同亞單位組成的對稱六聚體，與免疫復合物的Fc段結合后，介導CDC效應，募集血清中存在的大量C1q，形成膜攻擊復合物（membrane attack complex， MAC），誘導靶細胞裂解［6-8］。用于治療B細胞淋巴瘤的抗CD20利妥昔單抗依賴CDC效應控制并清除惡性B細胞。目前，關于增強抗體CDC活性的研究主要聚焦于Fc段與C1q的親和力。經分子間Fc-Fc相互作用形成的IgG六聚體是六價C1q的最佳結合位點［9-11］。Jong等［11-12］研究發現，Fc段單點突變（E430G）使IgG更容易形成六聚體形式，增強CDC活性；而Wang等［13］發現，Fc段的單價靶點具有更有利的幾何定位，能夠更恰當地與C1q結合，激活CDC效應。

1.1.2 延長功能蛋白半衰期內源性IgG在FcRn的保護下，半衰期可達19 d。在酸性環境下，即細胞內涵體中（pH 6.0～6.5），IgG-Fc段與FcRn相互作用，2個FcRn分子結合1個IgG分子，形成穩定復合物，延緩溶酶體對IgG的降解，延長IgG的血漿半衰期；而在pH7.4的生理環境下，二者不結合，因此FcRn以pH依賴性的方式維持血液循環中高水平的抗體濃度［14］。多肽及一些普通蛋白分子量較小，易被內源性蛋白酶、肽酶水解，腎臟清除速率較快、半衰期較短，嚴重阻礙蛋白分子的藥物開發［15］。然而將小分子蛋白或多肽與Fc段構建成融合蛋白后，賦予了蛋白分子類似于抗體的性質，通過Fc段與FcRn的作用，其血漿半衰期被顯著延長，能夠在體內發揮長效作用。例如，內源性胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）易被二肽基肽酶-4（dipeptidyl peptidase， DPP-4）水解失活，而將GLP-1突變體與hIgG4-Fc融合后得到的杜拉魯肽在體內長效激活GLP-1R，維持血糖穩定。

1.2 功能蛋白的性質Fc融合蛋白的藥理學特性除由Fc段介導的細胞毒性作用和延長半衰期外，功能蛋白特有的藥理活性同樣重要。不同于以腫瘤抗原為靶點的單克隆抗體，Fc融合蛋白的功能蛋白種類、來源、靶點、效應都更加廣泛，在治療性單克隆抗體的基礎上改善藥效，彌補缺陷。例如，在用于治療年齡相關的濕性黃斑變性（wet age-related macular degeneration，wAMD）的生物制劑中，雷珠單抗為單靶點藥物，僅能作用于血管內皮生長因子的A亞型（vascular endothelial growth factor-A， VEGF-A），而 阿 柏西普和康柏西普這2種Fc融合蛋白類藥物，可與VEGF-A、VEGF-B、胎盤生長因子（placental growth factor， PLGF）結合，發揮更高效的抗腫瘤活性。百健艾迪研發的重組凝血因子Ⅷ-Fc融合蛋白（efmoroctocog alfa）可暫時性替代凝血過程中缺失的凝血因子，用于預防和治療A型血友病。此外，功能蛋白氨基酸殘基的微小變化也可導致其親和力和生物活性發生顯著改變，從而改善其治療特性。例如，2005年被FDA批準用于治療類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis，RA）的Fc融合蛋白藥物阿巴西普，其功能蛋白為細胞毒性T淋巴細胞相關 蛋 白-4（cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4， CTLA-4）的胞外段。對CTLA-4進行定點突變、替換氨基酸殘基（A29Y/L104E）得到的貝拉西普，與CD80和CD60的結合顯著增強［16-17］。2011年，貝拉西普被批準上市，用于抑制器官移植排斥反應［18］。IL-2-Fc三重突變體（IL-23XFc，R38D/K43E/E61R）與CD25的結合被抑制，優先促進CD25-CD122highMP（memory-phenotyp）CD8和NK細胞的增殖，活性、選擇性較IL-2WTFc和IL-2/mAb復合物明顯提高［19］。

2 重組Fc融合蛋白的分子設計

2.1 Fc骨架亞型的選擇不同的IgG亞型與FcγRs的親和力不同，導致其免疫學活性存在差異。hIgG的4個 亞 型 中，IgG1、IgG3與Ⅰ型FcγRs（FcγRⅠ、FcγRⅡA、FcγRⅡB、FcγRⅡC、FcγRⅢA、FcγRⅢB）的親和力較高，目前關于重組Fc融合蛋白藥物的研究多選用IgG1。由于IgG3的鉸鏈區較長，易被蛋白酶水解，半衰期較短，導致其藥用功能的開發受到阻礙［20-21］。但有研究［20］發現，IgG3-FcR435H突變體與FcRn的結合明顯強于非突變體，體內半衰期接近IgG1，對肺炎鏈球菌感染小鼠有強效保護作用。因此，當功能蛋白的存在會阻斷IgG1-Fc與FcRs結合，而限制IgG1-Fc活性時，有較長鉸鏈區的IgG3-FcR435H突變體將成為最佳的替代性選擇［22］。而hIgG2和hIgG4的Fc段 與FcγRs、C1q的 親和力較弱，因此可以用于自身免疫性疾病及異體移植排斥反應等需要免疫抑制治療的疾病藥物 開發。

除IgG-Fc之外，以其他免疫球蛋白Fc段為骨架的Fc融合蛋白可靶向適應性免疫細胞上的FcRs。例如，主要存在于黏膜組織的IgA與FcαR相互作用可誘導強烈抑制信號和凋亡信號，阻斷其他受體的激活，因此，以IgA-Fc為骨架的融合蛋白可被開發，用于黏膜部位抗炎［23-24］。而能夠與B、T（CD4＋、CD8＋）及NK細胞結合并刺激記憶反應的IgM-Fc段是疫苗中最佳的天然佐劑［25］。IgEFc的受體表達在APCs（包括大部分DCs）表面。相關研究表明，抗原-IgE-Fc融合蛋白可能在基于細胞的腫瘤疫苗中有特殊用途［26］，IgE-Fc段也可用于抑制過敏反應的藥物研究［27］。這些疫苗策略向臨床的安全轉化還需進行全面深入評估。

2.2 糖基化的選擇由Fc段糖基化的不同所導致的結構差異會影響Fc段與FcγRs、補體蛋白、FcRn等配體的結合，進而影響后續的ADCC、CDC效應及血漿半衰期。Fc段CH2結構域Asn297位的N-連接聚糖是一個核心七糖結構，包括4個N-乙?；?葡萄糖胺和3個甘露糖殘基及數目可變的半乳糖、巖藻糖、唾液酸殘基，這些糖基是Fc段發揮生物學功能所必需的［28］，因此糖基化也被認為是治療性抗體類藥物的關鍵質量屬性（critical quality attributes，CQA）［29］。Fc段N-聚糖核心結構可在酶作用下被修飾為不同的糖基化結構，主要分為核心巖藻糖基化、末端唾液酸化、甘露糖基化等［30］。

Shields等［31］研究發現，相比于非巖藻糖基化的IgG，巖藻糖基化的Fc段所介導的ADCC效應被降低100倍，而CDC活性無變化。另外，在重組Fc融合蛋白中，唾液酸的含量越高，同樣會導致Fc段與FcγRs的親和力降低，從而抑制ADCC活性［32］。然而，經研究［33］發現，末端唾液酸化的IgG型抗體體內半衰期被顯著延長。因此，當融合蛋白中Fc段僅起到延長功能蛋白半衰期的作用時，可選擇巖藻糖基化、唾液酸化修飾，抑制Fc段的ADCC活性，減少不良反應。然而，與唾液酸化恰好相反，甘露糖基化所具有的縮短半衰期和增強ADCC效應的雙重屬性使其更適用于臨床急性感染的控制。甘露糖基化的融合蛋白在體內清除病原體后，與肝臟巨噬細胞表面的甘露糖受體結合，被快速代謝，避免了藥物長時間在體內殘留可能出現的脫靶毒性［34］。如何精確地選擇并控制各種糖基化及其在Fc融合蛋白分子中所占比例，在藥效學與藥代動力學之間達到最佳平衡，對其成藥性至關重要，是目前此類藥物開發中需要考慮的重要問題。

2.3 Fc段的FcRn高親和力突變體良好的藥代動力學特性是抗體類藥物相比于傳統藥物的一大優勢。得益于Fc段與FcRn的結合保護作用，Fc融合蛋白的半衰期較普通蛋白分子明顯改善，但仍不及IgG型全長抗體（3周）［2］。因此，進一步改善Fc融合蛋白的藥代動力學也是其藥物開發重點關注的問題。借助基因工程平臺技術，對融合蛋白的Fc段進行氨基酸定點突變，改善Fc段與FcRn的親和力，可得到更為長效穩定的突變體。例如，阿斯利康制藥有限公司研制的呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）靶向抗體莫維珠單抗（motavizumab），其“YTE”突變體（M252Y/S254T/T256E）motavizumab-YTE， 在pH6.0時與FcRn的親和力較非突變體增強10倍，在健康人體內半衰期可達100 d，約為非突變體的4 倍［35］。Motavizumab-YTE的265位谷氨酸（Glu， E）側鏈酸根基團的氧原子與FcRn-Q2殘基側鏈的氨基之間形成穩定的氫鍵；而254、252位分別突變為蘇氨酸（Thr， T）和酪氨酸（Tyr， Y）之后，引入了新的甲基和苯環，增強了Fc段與FcRn疏水殘基（L82、Y88、L112）的疏水相互作用。Zheng 等［36］將丁酰膽堿酯酶BChE（內源性可卡因代謝酶）的突變體CocH3的1～529位與hIgG1-Fc段融合，在“YTE”突變的基礎上再進行A530V/D671E/L673M突變，得到CocH3-Fc(M6)變體，與FcRn的親和力顯著增強。CocH3-Fc在小鼠體內的半衰期約為4 d，而M6變體的半衰期長達9 d。

3 重組Fc融合蛋白的應用

3.1 Fc融合蛋白類藥物與傳統生物制劑相比，Fc融合蛋白類藥物半衰期長、特異性良好、靶點種類多、臨床應用廣泛等優勢已得到廣泛認可［37］。1998年，FDA批準了第1個Fc融合蛋白類藥物——依那西普，用于RA、強直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）的治療，療效顯著。目前，已有13種此類藥物被FDA批準用于腫瘤、自身免疫性疾病、血液病、炎性疾病、移植排斥的治療（表1）［6］，還有大量藥物正處于臨床前或不同的臨床研究階段，涉及感染、藥物成癮等多個研究方向。

表1 已上市的重組Fc融合蛋白類藥物

3.1.1 VEGF受體拮抗劑血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是 一種高特異性的促血管內皮細胞生長因子，誘導新生血管形成，可分為A、B、C、D、E和PLGF 6種亞型。將VEGF-A、VEGF-B受體的胞外段通過TNT序列串聯后，與hIgG1-Fc的鉸鏈區N端融合形成的多特異性融合抗體阿柏西普（aflibercept， AFL）是VEGF受體拮抗劑。AFL與VEGF-A、VEGF-B、PLGF結合，阻斷這些因子與其內源性受體的結合與活化，從而抑制新生血管形成，發揮直接的抗腫瘤活性。AFL還可用于治療新生血管引起的眼科疾病，給藥方式因患者疾病的不同而有差異，Zaltrap和Eylea這2種藥物中所含的AFL相同，但配比不同［38］。前者用于治療對含奧沙利鉑方案耐藥的轉移性結直腸癌，后者則在2011年被FDA批準用于治療wAMD和視網膜靜脈阻礙或糖尿病引起的黃斑水腫。

3.1.2 長效GLP-1R激動劑美國禮來公司研發的長效胰高血糖素樣肽-1受體（glucagon like peptide-1 receptor，GLP-1R）激動劑杜拉魯肽［39］由天然GLP-1突變體（A8G/A22E/R36G）以3段重復的GGGGS氨基酸序列為linker與hIgG4的Fc段的N端連接，單體再通過鉸鏈區鏈間二硫鍵形成二聚體（圖1）。GLP-1突變體彌補了天然GLP-1易被DPP-4降解失活的缺點，且活性與內源性GLP-1相似，激活GLP-1R，以血糖依賴的方式促進胰島β細胞分泌胰島素，并抑制胰島α細胞分泌胰高血糖素，維持血糖穩定，避免了傳統降糖藥可能導致低血糖的風險，且體內半衰期可延長至5 d［40］。2014年9月，經FDA批準，杜拉魯肽皮下注射液正式上市，用于治療成人2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus， T2DM）。除單用形式外，杜拉魯肽還可與二甲雙胍、磺脲類、噻唑烷二酮或者膳食胰島素聯用，在有良好飲食計劃和定期體育鍛煉的患者中，藥效更優。

圖1 杜拉魯肽示意圖

3.1.3 TPOR激動劑Fc融合蛋白的功能分子大多在Fc段鉸鏈區的N端與其融合。但血小板生成素受體激動劑羅米思亭（Nplate）的分子結構（圖2）較為特殊，2個血小板生成素結合肽（thrombopoietin-binding peptide，TPBP）經8個甘氨酸串聯形成多肽，再通過由5個甘氨酸組成的linker與Fc段CH3區域的C端融合［41］。TPBP的序列（IEGPTLRQWLAARA）不同于天然血小板生成素（thrombopoietin，TPO）的主要序列，是通過多種生物方法篩選而來的一段共同序列，與TPO競爭性結合血小板生成素受體（TPOR）［42］， TPBP對TPOR的親和力高，可有效促進巨核細胞的增殖和成熟［43］。2008年，FDA批準羅米思亭用于慢性免疫性血小板減少性紫癜（immune thrombocytopenic purpura， ITP）治療。

圖2 羅米思亭示意圖

3.2 Fc融合蛋白在疫苗中的應用抗原-Fc融合蛋白可特異性靶向APCs表面的FcRs，這一特性是其在疫苗領域中應用的基礎。通過CH2-CH3結構的鏈間二硫鍵可將單體Fc融合蛋白構建為可攜帶12個抗原分子的六聚體，與APCs的受體交叉連接，提升抗原呈遞效率。Fc段與特定抗原融合已經成為一種新型的黏膜疫苗接種策略，用于預防傳染性疾?。?4］，例如流感（HA-HuFc）［45］、單純皰疹病毒（HSV，gD-Fc）［44］、結核?。‥SAT6:HspX:Fc）［46］、 豬瘟病毒（E2-Fc）［47］。Zhang等［48］將RSV的F糖蛋白與IgG的Fc段融合形成六聚體F-Fc融合蛋白，以TLR4激動劑單酰磷脂A(MPL)為佐劑聯合免疫小鼠，可減輕RSV感染后的肺部損傷。

3.3 靜脈免疫球蛋白療法Fc段的唾液酸殘基與抑制性非經典FcγRs相互作用，如DC特異性細胞間黏附分子3-整合素（DC-SIGN）或鼠源同系物SIGN-R1、B細胞表面的CD22（Siglec-2），誘導APCs表達FcγRIIB，抑制APCs的抗原呈遞功 能［49］，介導IVIG的抑制作用。Fc結構域的CH2結構域存在混雜的致耐受性表位，有學者［50］提議將其命名為“Tregitopes”，其中一些Tregitopes與FcγR、FcRn的結合位點存在交疊。降解后的IgGFc經MHC-Ⅱ類分子處理并呈遞后，限制性活化Treg細胞。這一結果與IgG-Fc參與誘導耐受性的多重機制的理論相符合?？傊?，包括FcγR依賴型、非依賴型在內的多重作用機制，通過Fc結構域的耐受性誘導活性，介導IVIG的抗炎活性。

3.4 非臨床應用隨著Fc融合蛋白臨床應用的快速發展，其非臨床應用也受到了廣泛關注，如流式細胞術、免疫組化、蛋白質芯片設備等［51］。哺乳動物細胞內存在一些難以表達的蛋白質，可將其與IgG3的Fc段融合形成構建體，增強蛋白質的穩定性，達到穩定生產的目的［52］。在蛋白質微陣列應用中，Fc融合蛋白被整合到具有支架的多價絡合物中，例如Protein-G/A微珠，作為鑒別新型低親和力蛋白質相互作用的高通量方法，彌補了質譜和酵母雙雜交技術無法檢測低親和力結合現象的 缺陷。

綜上所述，重組Fc融合蛋白具有更精準的靶向性，特異性強、穩定性良好。然而僅將天然的功能蛋白與Fc段融合已不能滿足各種復雜疾病的臨床治療需求。重組Fc融合蛋白類藥物的開發可合理應用合成生物學技術，改善天然位點，開發全人造抗原結合位點，對Fc段進行定點突變、糖基化、脫酰胺化改造，以期望得到藥效學、藥代動力學性質優異且不良反應少的重組Fc融合蛋白類藥物。另外，以融合蛋白為基礎的CAR-T細胞免疫療法、雙特異性抗體以及多價、多特異性抗體的迅速發展更是為腫瘤、自身免疫性疾病、重癥感染等臨床疾病提供了新的治療措施與方向。

利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。