指甲花香豆素類成分提取工藝優化及其抑菌活性評價

許亞麗，何念武

（1.商洛學院 生物醫藥與食品工程學院，陜西商洛 726000；2.西北大學 生命科學學院，陜西西安 710127）

指甲花，學名鳳仙花（Impatiens balsamina），是一種天然植物染料，在民間常被用來染頭發或指甲，亦可作為園藝觀賞植物。與大部分藥用植物一樣，指甲花化學成分復雜，富含醌類、黃酮類和香豆素類等生物活性成分，還含有脂肪酸、揮發油等成分[1]。研究表明，指甲花具有抗真菌、抗氧化及消炎鎮痛等臨床作用[1-2]，在醫學上可用于祛風除濕及治療風濕、痛風和甲癬等。指甲花還具有食療價值，可炒食或制成保健飲料等[3]。

香豆素類成分主要包括白蠟樹亭、東茛菪素和七葉亭等[4]，存在于自然界許多植物中，作為植物化學成分之一常帶有香味。龔蕾等[5]綜述了提取香豆素的常用方法，主要有水蒸氣蒸餾提取法、堿溶酸沉提取法、系統溶劑提取法和色譜提取法等，并簡要分析各方法的優缺點，其中系統溶劑提取法具有操作簡單和成本低等優勢。袁園等[6]通過微波輔助溶劑提取法提取白芷（Angelica dahurica）中的香豆素，結果顯示該方法具有高效、省時和便捷等優點。微波輔助溶劑提取法主要通過洗料、清洗、粉碎、分離、濃縮和干燥等步驟獲得產品，既克服了系統溶劑提取法操作時間過長的缺點，又集合了微波輔助的優勢，目前已被廣泛應用于植物化學成分的提取[7]。

國內外學者在關注植物化學成分提取分離的同時，積極開展化學成分抗氧化、抗菌和消炎等生物活性的研究。黎秋華等[8]采用不同溶劑對指甲花花瓣進行粗提，并進行粗提物體外抑菌試驗，結果顯示不同溶劑粗提物均對細菌有抑制作用，其中75%丙酮提取物的抑菌效果最強。董晨虹等[9]通過藥敏試紙（濾紙片）法比較指甲花不同部位的抑菌能力，結果表明指甲花花瓣對真菌生長有明顯的抑制作用。米爾班古麗·阿卜杜如蘇力等[10]對指甲花粗提液進行體外抑菌活性篩選試驗，結果表明指甲花粗提液對常見致病菌大腸埃希菌（Escherichia co?li）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）等的抑菌活性隨濃度的增大而增加。上述研究均表明指甲花有良好的抑菌活性，但并未明確指甲花抑菌活性成分。Malekzadeh 等[11]研究表明，指甲花的抗菌活性可能與其所含的活性成分2-羥基-1,4-萘醌，即指甲花醌類成分有關。為進一步了解指甲花的抑菌活性成分，本研究采用微波輔助溶劑提取法提取指甲花中的香豆素類成分，基于提取溫度、提取時間、料液比及乙醇濃度4個單因素試驗結果，采用正交試驗設計進行工藝優化，并采用抑菌圈法考察指甲花香豆素類成分的體外抑菌活性，以期為指甲花資源的綜合利用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

指甲花、香豆素（批號：20210310，上海邁坤化工有限公司）、乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、牛肉膏、氯化鈉、瓊脂、蛋白胨、大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌（由商洛學院生物醫藥與食品工程學院微生物學實驗室提供）。

1.2 指甲花香豆素檢測波長

采用紫外全波長掃描儀檢測香豆素對照品和待測樣品的最大吸收波長，確定后續香豆素類成分提取率的檢測波長[12]。準確吸取香豆素對照品溶液2.5 mL 和供試品溶液1.5 mL 于10.0 mL 容量瓶中，無水乙醇定容，倒置搖勻，在200 ～500 nm 波長下分別掃描對照品和供試品溶液，找出最大吸收峰，確定檢測波長。

1.3 指甲花香豆素類成分提取率測定

1.3.1 繪制標準曲線

對照品溶液配制：準確稱取香豆素對照品25.0 mg，采用無水乙醇溶解，定容于500.0 mL 容量瓶中，得到50.0 μg/mL香豆素對照品溶液。

供試品溶液制備：稱取2.0 g 指甲花粉末（粉碎機打粉，過80 目篩），置于150.0 mL 容量瓶中，加入60.0 mL 無水乙醇，微波輔助加熱冷凝回流90 min，提取溫度60 ℃，放冷后過濾；濾渣中加入30.0 mL無水乙醇，按照上述條件重復提取1 次，過濾；將兩次濾液合并后置于150.0 mL 容量瓶中，無水乙醇定容，倒置搖勻。精確吸取0.5 mL 溶液置于10.0 mL容量瓶中，無水乙醇定容，得到供試品溶液。

標準曲線繪制：分別吸取0.2、0.3、0.5、0.7 和1.0 mL對照品溶液至10.0 mL容量瓶中，無水乙醇定容，稀釋成不同濃度的香豆素對照品溶液。以無水乙醇為空白對照，在一定波長處檢測各組吸光值。

1.3.2 方法學考察

精密度試驗：準確吸取香豆素對照品溶液0.5 mL于10.0 mL 容量瓶中，無水乙醇定容，在測定波長處連續測定5 次吸光度，計算相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），判斷儀器的精密度。

式中，S為標準偏差為吸光度均值。

穩定性試驗：取指甲花提取液在室溫下分別放置2、4、8、12、24 和30 h，在確定的波長下測定不同時間下的吸光度，計算RSD，判斷指甲花提取液在30 h內的穩定性。

重復性試驗：稱取2.0 g指甲花粉末，置于150.0 mL圓底燒瓶中，加入60.0 mL 95%乙醇，回流提取1.5 h，提取溫度60 ℃，冷卻后過濾；濾渣中加入30.0 mL 95%乙醇，按照上述條件重復提取1 次，過濾；將兩次濾液合并后置于150.0 mL 容量瓶中，吸取0.5 mL置于10.0 mL 容量瓶中，無水乙醇定容，得到指甲花粗提液。重復6 次。在確定的波長下，測定待測液的吸光度，計算RSD，判斷該方法的重復性。

1.3.3 香豆素類成分提取率計算

設置檢測波長為270 nm，按照回歸方程計算指甲花乙醇提取液的濃度，再根據提取率公式計算指甲花香豆素類成分的提取率（%）。

式中，C為指甲花提取液的濃度（g/mL）；V為提取液的體積（mL）；M為指甲花粉末的質量（g）[6]。

1.4 方法

1.4.1 乙醇浸提指甲花中香豆素類成分的單因素試驗

以指甲花粉末為原料，采用冷凝回流法，以總香豆素量為指標，考察提取時間、提取溫度、料液比和乙醇濃度對香豆素類成分提取率的影響。

（1）提取溫度對提取效果的影響

準確稱取3.0 g 指甲花粉末6 份，分別置于100.0 mL 圓底燒瓶中，加入60.0 mL 50%乙醇，加熱回流90 min，分別調節水浴鍋的溫度為40、50、60、70、80 和90 ℃，放冷后過濾；濾渣中加入30.0 mL 50%乙醇，按照上述條件重復提取1 次，過濾；將兩次濾液合并后置于150.0 mL 容量瓶中，無水乙醇定容，搖勻。準確吸取0.5 mL 溶液，無水乙醇稀釋并定容至10.0 mL。測定吸光度，計算各組香豆素類成分提取率。

（2）提取時間對提取效果的影響

準確稱取3.0 g 指甲花粉末6 份，分別置于150.0 mL 圓底燒瓶中，加60.0 mL 70%乙醇，調節水浴鍋溫度為60 ℃，分別加熱回流50、60、90、110、120和150 min，放冷后過濾；濾渣中加入30.0 mL 70%乙醇，按照上述條件重復提取1 次，過濾；將兩次濾液合并后置于150.0 mL 容量瓶中，無水乙醇定容，搖勻。準確吸取0.5 mL 溶液，無水乙醇稀釋并定容至10.0 mL。測定吸光度，計算各組香豆素類成分提取率。

（3）料液比對提取效果的影響

準確稱取3.0 g 指甲花粉末6 份，分別置于100.0 mL 圓底燒瓶中，分別按照1∶10、1∶15、1∶20、1∶30、1∶40 和1∶50 的料液比（指甲花粉末與提取溶劑之比，mg∶mL）加入50%乙醇，加熱回流提取90 min，調節水浴鍋溫度為60 ℃，放冷后過濾；濾液置于150.0 mL容量瓶中，無水乙醇定容，搖勻。準確吸取0.5 mL溶液，無水乙醇稀釋并定容至10.0 mL。測定吸光度，計算各組香豆素類成分提取率。

（4）乙醇濃度對提取效果的影響

準確稱取3.0 g 指甲花粉末6 份，分別置于100.0 mL圓底燒瓶中，分別加入60.0 mL體積分數分別為10%、30%、50%、70%和95%的乙醇，加熱回流提取90 min，調節水浴鍋溫度為60 ℃，放冷后過濾；濾渣中加入30.0 mL 對應濃度乙醇，按照上述條件重復提取1次，過濾；將兩次濾液合并后置于150.0 mL容量瓶中，無水乙醇定容，搖勻。準確吸取0.5 mL溶液，無水乙醇稀釋并定容至10.0 mL。測定吸光度，計算各組香豆素類成分提取率。

1.4.2 正交試驗優化指甲花中香豆素類成分提取工藝條件

根據上述4 個單因素試驗結果，選擇適宜的提取溫度、提取時間、料液比及乙醇濃度，設置4 個單因素的正交試驗（表1）。

表1 正交試驗設計因素水平Tab.1 Factor levels of orthogonal experimental design

1.5 抑菌圈法測定指甲花香豆素類成分抑菌活性

1.5.1 培養基制備

配置牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基。稱取10.0 g 牛肉膏、10.0 g蛋白胨、5.0 g氯化鈉和20.0 g瓊脂，溶解于1 000.0 mL蒸餾水中，調節pH為7.0 ～7.2，設置高壓滅菌鍋的時間為20 min，滅菌后干燥保存備用。

1.5.2 菌懸液和濾紙片制備

將大腸埃希菌等細菌在斜面培養基中活化；將已活化的細菌于無菌條件下接種于50.0 mL 細菌培養液中，置于培養箱中，在37 ℃條件下培養24 h。用打孔器將定性濾紙制成直徑為6 mm的圓片，進行高壓蒸汽滅菌，保存備用[9]。

1.5.3 指甲花香豆素提取物抑菌活性檢測

稱取適量指甲花香豆素提取物，配置成1.0 g/mL的供試品溶液。取適量供試品溶液，用鹽酸和氫氧化鈉分別調節指甲花香豆素提取液的pH 為4、5、6、7、8 和11，將直徑為6 mm 的濾紙片放入溶液中浸潤20 min，晾干后貼在培養皿內，加入滅菌的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基，混勻；待平板凝固后，取預先配置好的0.1 g/mL 大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌混懸液100.0 mL分別加入平板中央，均勻涂布；無菌水為對照。平板凝固后，在37 ℃生化培養箱中培養24 h，觀察細菌生長情況，測量抑菌圈的直徑，重復3 次。記錄數據，計算各pH 條件下3 個培養皿抑菌圈直徑的均值。一般而言，抑菌圈直徑大于1 cm，說明有抑菌效果；小于或等于1 cm，說明沒有抑菌效果；抑菌圈直徑越大，抑菌效果越強[8-10]。

1.6 數據處理

采用Excel 2016 軟件進行數據處理；采用SPSS 18.0軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 檢測波長

對照品溶液在269 nm 處有最大吸收峰，此時吸光度為0.49；供試品溶液在270 和271 nm 處有最大吸收峰，此時吸光度為0.78；兩者最大吸收峰相近（圖1）。因此，本研究將檢測波長確定為270 nm。

圖1 香豆素對照品及供試品溶液紫外掃描圖Fig.1 UV scans of coumarin reference substance and test substance solutions

2.2 標準曲線繪制

以香豆素濃度（μg/mL）為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程y = 0.026 4 x +0.506 1，R2=0.994 3（圖2）。

圖2 香豆素對照品溶液標準曲線Fig.2 Standard curve of coumarin reference substance solution

2.3 方法學考察結果

2.3.1 精密度試驗

在270 nm 的檢測波長處，連續5 次對香豆素對照品溶液的吸光度進行測定（n=5），RSD 為1.03%，說明所使用的紫外分光光度計精密度良好。

2.3.2 穩定性試驗

在270 nm 的檢測波長處，分別在2、4、8、12、24和30 h 測定指甲花提取物的吸光度，RSD 為1.36%，說明指甲花提取液在30 h內較穩定。

2.3.3 重復性試驗

在270 nm 的檢測波長處，測定并記錄吸光值，RSD為1.25%，說明該提取方法有較好的重復性。

2.4 單因素試驗結果

2.4.1 提取溫度對香豆素類成分提取率的影響

隨提取溫度增加，指甲花香豆素類成分提取率呈先升后降的趨勢；提取溫度為60 ℃時，提取率最高（0.12%）；溫度上升至90 ℃時，提取率較低，可能是高溫破壞了香豆素類成分活性成分的結構（圖3）?；趩我蛩卦囼灲Y果，正交試驗最佳提取溫度初步確定為60 ℃。

圖3 提取溫度對香豆素類成分提取率的影響Fig.3 Effects of extraction temperatures on extraction rate of coumarins

2.4.2 提取時間對香豆素類成分提取率的影響

隨提取時間延長，指甲花香豆素類成分提取率呈先升后降的趨勢；提取時間為90 min時，提取率最高（0.13%）（圖4）?；趩我蛩卦囼灲Y果，正交試驗最佳提取時間初步確定為90 min。

圖4 提取時間對香豆素類成分提取率的影響Fig.4 Effects of extraction time on extraction rate of coumarins

2.4.3 料液比對香豆素類成分提取率的影響

隨料液比增加，指甲花香豆素類成分提取率呈先升后降的趨勢；料液比為1∶30 時，提取率最高（0.13%）（圖5）?；趩我蛩卦囼灲Y果，正交試驗最佳料液比初步確定為1∶30。

圖5 料液比對香豆素類成分提取率的影響Fig.5 Effects of solid-liquid ratios on extraction rate of coumarins

2.4.4 乙醇濃度對香豆素類成分提取率的影響

隨乙醇濃度增加，指甲花香豆素類成分提取率呈先升后降的趨勢；乙醇濃度為50%時，提取率最高（0.10%）（圖6）。基于單因素試驗結果，正交試驗最佳乙醇濃度初步確定為50%。

圖6 乙醇濃度對香豆素類成分提取率的影響Fig.6 Effects of ethanol concentrations on extraction rate of coumarins

2.5 正交試驗優化結果及分析

2.5.1 正交試驗結果

從單因素試驗結果可以看出，不同的提取溫度、提取時間、料液比及乙醇濃度對指甲花香豆素類成分提取率的影響程度不同，基于單因素試驗結果選取各因素較優水平進行正交試驗優化（表1）。香豆素類成分提取率為0.04% ～ 0.16%；處理7（A3B1C3D2）的提取率最高（0.16%）（表2）。通過極差分析，各因素對香豆素類成分提取率的影響為料液比＞乙醇濃度＞提取溫度＞提取時間，最佳組合為A3B2C3D2，即提取溫度60 ℃、提取時間90 min、料液比1∶40和乙醇濃度70%。

表2 正交試驗結果與極差分析Tab.2 Results and range analysis of orthogonal experiment

2.5.2 驗證試驗

將實際最優組合和理論最優組合進行同步3 次驗證試驗（表3）。在理論最優組合下，香豆素類成分平均提取率為0.185%，高于實際最優組合。

表3 驗證試驗結果Tab.3 Results of validate experiment (%)

2.6 不同pH條件下香豆素類成分提取液抑菌活性

酸性條件下，指甲花香豆素類成分提取液抑菌效果較強，堿性條件下次之，中性條件下較弱（表4）。隨pH 增加，香豆素類成分提取液的抑菌效果呈降低趨勢；pH 為11 的近強堿性條件下，抑菌效果又有所增強。原因可能是在強酸或強堿的極端條件下，大腸埃希菌等細菌的生長受到抑制，抑菌圈較大[13]。與對照相比，指甲花香豆素類成分提取液對大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的生長均有顯著抑制作用（P＜0.05）；大腸埃希菌的抑菌圈平均直徑為11.74 mm，金黃色葡萄球菌的抑菌圈平均直徑為13.77 mm。

表4 不同pH條件下指甲花香豆素類成分提取液抑菌效果Tab.4 Antibacterial effects of coumarins extracts from I.balsamina in different pH conditions

3 討論與結論

本研究選用微波輔助溶劑提取法提取指甲花中的香豆素類成分，既克服了系統溶劑提取法操作時間過長的缺點，又結合了微波輔助的優勢[7]。抑菌活性研究采用抑菌圈法，通過測量抑菌圈的直徑大小來判斷抑菌效果。還可通過平板菌落計數法計算抑菌率，但平板菌落計數法待測樣品菌液往往不宜完全分散成單個細胞，形成的菌落有可能來自樣品中的2 ～3 個或更多個細胞，試驗結果準確度偏低。

本研究以提取指甲花香豆素類成分和研究其抑菌活性為出發點，對提取工藝進行優化，得到的最佳提取工藝條件為提取溫度60 ℃、提取時間90 min、料液比1∶40 和乙醇濃度70%。最佳提取工藝提高了有效成分的含量，提取率為0.185%。抑菌活性試驗結果表明，指甲花香豆素類成分提取液有一定程度的抑菌效果，大腸埃希菌的抑菌圈平均直徑為11.74 mm，金黃色葡萄球菌的抑菌圈平均直徑為13.77 mm。

我國中藥資源豐富，大部分中藥材中均含有潛在的抑菌成分[14-16]，篩選植物天然抑菌活性成分并探究其抑菌機理已成為植物化學領域的研究熱點。指甲花在我國南北方地區均有分布，多以園藝觀賞為主，易于成活且生存能力強，種植成本較低，醌類、香豆素類和黃酮類活性成分含量較高，具有較強生物活性[17-18]，在抑菌方面有廣闊前景，在供園藝觀賞的同時有望成為制備抗菌洗液等日用品的化工原料。本研究未對深層次的指甲花香豆素類成分抑菌機理進行探討，可在后續工作中進一步研究。