非洲辣木組培快繁再生技術體系的建立

鐘連香，林 東，魏秋蘭，肖玉菲，劉海龍，覃子海

（廣西壯族自治區林業科學研究院，廣西南寧 530002）

非洲辣木（Moringa stenopetala）為辣木科（Mor?ingaceae）辣木屬植物，有豐富的營養和藥用價值[1]，在熱帶、亞熱帶國家和地區分布廣泛，在我國云南、廣東及廣西等地有大量種植[2]；辣木籽富含氨基酸、蛋白質、維生素及人體必需的礦物質元素，有較高的營養價值[3]；含有黃酮、多糖和多酚等生物活性物質，在抗氧化、消炎、抗癌和降血壓等方面作用顯著[4-5]，是藥食同源的植物，其營養和藥用價值已被廣泛證實并開發利用[6-7]。辣木（M. oleifera）具有速生、耐旱和抗病性強等特點，經濟效益好，是世界上熱門的多用途樹種之一[8]，同屬的非洲辣木也具有這些特點。關于辣木化學成分的藥理作用和營養成分方面的研究均取得了較好的進展[9-10]。基于辣木的潛在價值，并且辣木種子價格較高，傳統的種子育苗已不能滿足市場需求，辣木育苗技術[11]和栽培技術[12]日益成為研究熱點。關于辣木組織培養技術方面的研究也逐漸增多。陳麗文等[13]研究發現，辣木在MS + 6-BA 0.6 mg/L + IAA 0.2 mg/L 培養基上，培養增殖系數可達4.2，但在培養過程中出現葉子黃化脫落的現象；高敏霞等[14]的研究結果顯示，辣木的生根率可達80%，其生根培養基仍需繼續優化；張天翔等[15]的研究表明，辣木生根瓶苗移栽在泥炭土∶珍珠巖=1∶1 的基質中，成活率為80.6%。目前，非洲辣木組織培養技術尚不成熟，有必要對其開展無性快繁技術研究，摸索成熟的組培快繁體系，為非洲辣木推廣提供優質的種質資源。本研究以非洲辣木無菌苗為試驗材料，研究培養基和植物生長調節劑對其再生體系建立的影響，探索最適移栽基質，優化非洲辣木組培快繁再生技術，加快良種推廣應用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用材料為非洲辣木無菌苗。無菌苗由飽滿且健康的非洲辣木種子經無菌萌發獲得，種子原產于印度。

1.2 試驗方法

1.2.1 無菌苗誘導

將種子剝去外殼并用洗衣粉洗凈，置于超凈工作臺上消毒（75%酒精1 min + 0.1%升汞10 min）。將經消毒處理和無菌水沖洗后的種子接種于MS 培養基（蔗糖30 g/L，瓊脂6 g/L，pH 值6.0）上，放在培養架上培養。15 天時，統計發芽情況，計算發芽率（%）和污染率（%）。

1.2.2 愈傷組織誘導

采用6-BA 和KT 的組合進行愈傷組織誘導，基本培 養基 為MS 培 養基。6-BA 濃 度為0.1、1.0 和2.0 mg/L，KT 濃度為1.0 和2.0 mg/L，共6 個處理（表1）。將無菌苗切成2 ～2.5 cm 小段，接種至愈傷組織誘導培養基上。15 天后，統計出愈數，計算誘導率（%）。

1.2.3 繼代增殖培養

對誘導產生的不定芽進行切斷處理，保留2 cm左右的長度，以基本培養基（MS、WPM 和B5）、6-BA（0.2、0.6和1.2 mg/L）和KT（0.1、0.3和0.5 mg/L）為因素，進行L9（34）正交試驗設計（表2）。接種后，先暗培養10 天，再轉入正常光照培養。25 天后，統計各處理芽總數，計算增殖系數。

1.2.4 生根培養與移栽

以基本培養基（1/2 MS、1/2 WPM 和1/2 B5）、NAA（0.5、1.0 和1.5 mg/L）和IBA（0.5、1.0 和1.5 mg/L）為因素，進行L9（34）正交試驗設計（表3）。將增殖培養得到的小苗接種至培養基；接種后，用遮光布遮住進行暗培養，7 天后將遮光布掀開進行全光照培養；25 天后，統計苗木生根狀況，計算生根率（%）。將生根的試管苗移入大棚，在自然光下煉苗7天后，將生長健壯的生根苗分別移栽至椰糠、泥炭土、泥炭土∶椰糠= 1∶1、泥炭土∶椰糠= 1∶3 和泥炭土∶椰糠=3∶1 這5 種基質中。移栽30 天后，統計生長狀況，計算移栽成活率（%）。

1.3 培養條件

培養溫度為24 ℃，光照強度為6 000 lx，光周期為14 h/天。

1.4 數據處理

采用Excel 2016 軟件進行數據整理；采用SPSS 21.0 軟件對誘導率、增殖系數、生根率、生根數和根長進行方差分析和鄧肯氏新復極差檢驗。

2 結果與分析

2.1 無菌苗誘導情況

培養7 天后，種子開始萌動；15 天時，種子發芽率為81.11%，污染率為17.41%。

2.2 不同處理對愈傷組織誘導的影響

培養10 天后，開始出現少量愈傷組織。6 個處理的誘導率均在50%以上，處理3 和處理5 的誘導率達80%以上；處理3的誘導率最高（89.89%），顯著高于其他處理（P＜0.05）（表1）。6-BA 濃度為0.1 mg/L 時，隨KT 濃度升高，誘導率增加；6-BA 濃度為1.0 或2.0 mg/L 時，隨KT 濃度升高，誘導率降低。處理3 的誘導率高且愈傷組織生長較好，非洲辣木愈傷組織誘導的最適培養基為MS + 6-BA 1.0 mg/L +KT 1.0 mg/L。

表1 不同處理對愈傷組織誘導的影響Tab.1 Effects of different treatments on callus induction

2.3 不同處理對繼代增殖的影響

以MS 為基本培養基的處理更有利于繼代增殖，以WPM 和B5 為基本培養基處理的增殖效果較差（表2）。處理1 和處理2 的增殖系數均達4.0 以上，顯著高于其他處理（P＜0.05）；影響增殖系數的因素為培養基＞6-BA ＞KT。處理2 的增殖系數最高（4.62），非洲辣木不定芽增殖的最優培養基為MS+6-BA 0.6 mg/L+KT 0.3 mg/L。

表2 不同處理對繼代增殖的影響Tab.2 Effects of different treatments on subculture proliferation

2.4 不同處理對生根的影響

生根培養10 天后，小苗的基部切口處開始生根。各處理的生根率均在60%以上；處理6 的生根率最低（63.80%），顯著低于其他處理（P＜0.05）；處理1 和處理2 的生根率較高，均在94%以上；影響生根率的因素為NAA ＞培養基＞IBA（表3 ～4）。各處理的根長為1.38 ～2.18 cm，以1/2 WPM 為基本培養基處理的根長較短；影響根長的因素為培養基＞IBA ＞NAA。各處理的生根數均在3 根以上，處理1和處理7 的生根數較多，在6 根以上；以1/2 MS 和1/2 B5 為基本培養基處理的生根數較多；影響生根數的因素為培養基＞NAA ＞IBA。處理2 的生根率最高（96.67%），根長和生根數均表現較好，非洲辣木生根的最優培養基為1/2 MS + NAA 1.0 mg/L +IBA 1.0 mg/L。

表3 不同處理對生根的影響Tab.3 Effect of different treatments on rooting

2.5 不同基質對幼苗移栽的影響

在不同移栽基質中，幼苗的存活率均在80%以上；處理2 的存活率最高（94.44%）；處理5 次之（92.22%）；處理1 和處理4 的存活率較低，顯著低于其他處理（P＜0.05）（表5）。處理2的苗木存活率高且生長較好，泥炭土為最適合的移栽基質。

表5 不同移栽基質對幼苗存活率的影響Tab.5 Effects of different transplanting substrates on survival rates of seedlings

表4 不同因素的極差分析Tab.4 Range analysis on different factors

3 討論與結論

消毒是植物組織培養的關鍵環節[16]。處理方式、消毒試劑及消毒時間均會影響種子萌發。研究結果表明，非洲辣木種子經剝殼、清水中浸泡30 min + 75%酒精消毒1 min + 0.1%的升汞消毒10 min 處理后，消毒效果較好，種子發芽率較高，污染率較低。辣木外殼表面細菌多，剝除外殼結合消毒處理，可有效減少污染，提高發芽率。

培養基在繼代增殖過程中發揮重要作用。研究結果顯示，非洲辣木在以MS 為基本培養基的處理上增殖效果較好，與劉德承[17]的研究結果一致。MS 培養基中較高濃度的NH4+和NO3

-更適合非洲辣木不定芽的增殖。基本培養基只能使外植體存活下來，想要獲得更優質的試管苗，需添加植物生長調節劑促使其生長和分化。本研究在非洲辣木愈傷組織誘導和繼代增殖階段選用的植物生長調節劑為6-BA 和KT。相關研究表明，6-BA 濃度為0.5 ～1.2 mg/L 時，濃度與愈傷組織生長呈正相關[18]；6-BA 濃度為0.02 ～1.0 mg/L 時，隨濃度升高，愈傷組織生長增加[19]。本研究結果顯示，在非洲辣木愈傷組織誘導試驗中，KT 濃度為1.0 mg/L 時，隨6-BA濃度升高，誘導率先升后降，1.0 mg/L 時最高，與之前的研究結果基本一致。在誘導培養基中添加適量的KT 可改善愈傷組織的質量，延緩其器官分化能力的喪失，提高植株再生頻率[20]。本試驗結果顯示，6-BA 濃度為0.1 mg/L 時，KT 濃度的增加有利于愈傷組織誘導；6-BA 濃度為1.0 或2.0 mg/L時，愈傷組織誘導率與KT 濃度間存在“低促高抑”的現象，調節各植物生長調節劑的配比尤為重要。在繼代增殖過程中，培養基與植物生長調節劑間的相互作用共同影響非洲辣木的增殖。非洲辣木繼代增殖的最適培養基為MS 培養基；以MS 為基本培養基時，增殖系數隨6-BA 和KT 濃度的增加先增后降，6-BA 濃度為0.6 mg/L、KT 濃度為0.3 mg/L 時，增殖系數可達4.62，增殖效果最佳。

木本植物生根是離體培養的關鍵步驟[21]，培養基種類和植物生長調節劑等對組培苗生根均會產生一定影響。非洲辣木在無機鹽濃度較低的1/2 MS培養基上生根效果較好，高濃度無機鹽易使外植體切面產生愈傷組織，不利于生根。試管苗生根多屬于不定根，根原基不是植物體內固有的，而是在植物生長調節劑等因素作用下形成的，添加外源植物生長調節劑有利于不定根形成[22]。NAA 和IBA 是誘導不定根形成的常用植物生長調節劑，其不同濃度配比會對植物生根產生不同影響，因此需要調節各植物生長調節劑的配比，在保證生根的情況下，讓根多且粗壯，利于移栽成活。本試驗結果顯示，以1/2 MS 為基本培養基，NAA 為1.0 mg/L、IBA 為1.0 mg/L 時，非洲辣木生根率最高，生根數較多，根細長且愈傷組織少，利于苗木移栽成活。

移栽基質與移栽成活率和生長狀況密切相關[23]。本研究中，以泥炭土作為移栽基質，非洲辣木的移栽成活率高達94.44%，可能是因為泥炭土持水性和透氣性好，能減少水分流失，同時其腐殖質豐富，能為苗木生長提供足夠的養分。

非洲辣木種子經過剝殼處理，經清水浸泡30 min+75%酒精消毒1 min+0.1%升汞消毒10 min處理后，可達到很好的發芽效果；愈傷組織誘導最佳培養基為MS + 6-BA 1.0 mg/L + KT 1.0 mg/L，誘導率為89.89%；繼代增殖最佳培養基為MS+6-BA 0.6 mg/L + KT 0.3 mg/L，增殖系數為4.62；生根最佳培養基為1/2 MS+NAA 1.0 mg/L+IBA 1.0 mg/L，生根率為96.67%；以泥炭土作為移栽基質，能顯著提高試管苗的移栽成活率。綜合來看，在本研究建立的組培快繁技術體系下，非洲辣木外植體誘導、繼代增殖、生根培養及煉苗移栽效果理想，該技術體系可在工廠化育苗中推廣應用，可為非洲辣木快速繁殖和緩解種苗短缺提供保障。