水貂肺炎克雷伯菌的分離鑒定及耐藥性分析

陳 強，程悅寧，馮秋菊，郭 利，張淑琴，譚 斌，易 立，趙 權，程世鵬，孫 娜

(1.中國農業科學院特產研究所，農業農村部經濟動物疫病重點實驗室，長春 130112；2.吉林農業大學，長春 130118；3.四川省涼山彝族自治州農業農村局，農產品質量安全檢測中心，西昌 615000)

肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)是腸桿菌科克雷伯氏菌屬中最為重要的一類菌，呈卵圓形桿狀，單獨、成雙或短鏈狀排列，有較厚的莢膜，多數有菌毛，無芽孢，無鞭毛，廣泛分布于自然界。近年來，肺炎克雷伯菌已成為僅次于大腸桿菌的人畜共患條件致病菌[1]。肺炎克雷伯菌主要引起腸炎、尿路感染、膀胱炎、肺炎、腦膜炎、肝膿腫、內源性眼內炎及敗血癥等嚴重感染性疾病[2]。肺炎克雷伯菌主要引起水貂肺炎，表現為呼吸困難、發病急、死亡快，多發生于秋季溫暖潮濕的季節，目前該病已成為危害水貂養殖業的主要傳染病之一，給養貂業造成了嚴重的經濟損失[3]。對于該病的治療臨床上主要使用抗生素類藥物。近年來，由于抗生素的選擇壓力及不恰當的使用，致使肺炎克雷伯菌耐藥性日趨嚴重，呈現逐年上升趨勢，主要表現為多重耐藥現象[4-5]。因此，了解肺炎克雷伯菌的耐藥情況及解決其耐藥問題具有十分重要的意義。

本研究主要收集2019年吉林省某水貂養殖場送檢的6只患有肺炎的病死水貂的病料，通過細菌分離純化和PCR方法對分離菌株進行鑒定，采用多位點序列分型(multilocus sequence typing technique，MLST)方法測定分離菌株的基因型，通過感染小鼠確定菌株的致病性，分析菌株毒力基因的攜帶情況，檢測菌株對臨床常用抗菌藥物的敏感性及耐藥基因的攜帶情況，為臨床合理用藥提供科學依據和建議。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 標準菌株大腸埃希菌ATCC 25922由農業農村部經濟動物疫病重點實驗室保存；試驗菌株均分離自2019年吉林省某水貂養殖場送檢的患有肺炎的病死水貂的病料樣品。

1.1.2 主要試劑 LB肉湯、麥康凱瓊脂培養基均購自OXOID公司；PremixTaqVersion 2.0、DL2000 DNA Marker均購自寶生物工程(大連)有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒購自北京百泰克生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離純化及鑒定 收集病死水貂的肺臟，劃線接種于麥康凱瓊脂培養基上，于37 ℃培養箱中培養24 h。挑取麥康凱瓊脂培養基上的單個菌落接種于3 mL LB肉湯中，37 ℃振蕩培養過夜，待用。分離菌株經生化方法進行初步鑒定。

khe基因僅存在于肺炎克雷伯菌中，可作為鑒定肺炎克雷伯菌的特異性靶標。按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取菌株的基因組DNA，參考Neuberger等[6]合成khe基因引物(F：5′-TG-ATTGCATTCGCCACTGG-3′；R：5′-GGTCAAC-CCAACGATCCTG-3′)進行PCR鑒定。PCR反應體系25 μL：2×PCR Premix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/mL)各0.5 μL，模板DNA 1.0 μL，滅菌ddH2O補足體系。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，48 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環；72 ℃延伸10 min。取PCR擴增產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，選取PCR陽性產物送往吉林省庫美生物科技有限公司進行測序，將測序結果提交NCBI進行序列比對，確認目的基因。

1.2.2 菌株MLST分型 根據Diancourt等[7]報道的引物序列合成肺炎克雷伯菌擴增引物,引物序列見表1。PCR反應體系25 μL：2×PCR Premix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/mL)各0.5 μL，模板DNA 1.0 μL，滅菌ddH2O補足體系。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性20 s，退火(退火溫度見表1)30 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環；72 ℃延伸5 min。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，將擴增出目的條帶的PCR產物送至吉林省庫美生物科技有限公司進行測序，序列上傳至肺炎克雷伯菌的MLST數據庫(https:∥bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/klebsiella.html)進行比對，可獲得菌株的MLST型。

表1 肺炎克雷伯菌MLST引物

1.2.3 菌株致病性檢測 選擇35只SPF級昆明小鼠，共設定6個試驗組和1個對照組，每組各5只。將純化好的菌株接種于LB肉湯中，37 ℃振蕩培養過夜，用0.85%無菌生理鹽水稀釋菌液為1.0×109CFU/mL，試驗組每只小鼠腹腔注射0.2 mL菌液；對照組注射等量生理鹽水。對注射菌液后小鼠6、12、24、36、48和60 h的發病和死亡情況分別進行觀察記錄，并及時對死亡小鼠進行病原分離。

1.2.4 血清型及毒力基因檢測 根據和晉渝[8]報道引物序列合成引物，擴增莢膜多糖(K抗原)K1、K2、K3、K5、K20、K54、K57型7種血清型，以及rmpA、allS、iroNB、wcaG、kfuBC、fimH、ureA、ybtA、iucB、uge、wabG11種毒力基因。 PCR反應體系25 μL：2×PCR Premix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/mL)各0.5 μL，模板DNA 1.0 μL，滅菌ddH2O補足體系。PCR擴增產物使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，將鑒定正確的PCR產物送往吉林省庫美生物科技有限公司進行測序，確認目的基因。

1.2.5 藥敏試驗 根據美國臨床實驗室標準化委員會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)的指導原則，采用瓊脂稀釋法測定多黏菌素B、氨芐西林、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、阿米卡星、青霉素、氟苯尼考、環丙沙星、恩諾沙星、左氧氟沙星、頭孢曲松、頭孢噻呋、頭孢他啶、頭孢西丁、亞胺培南、美羅培南、多西環素18種藥物對菌株的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)。依據CLSI標準進行結果判定，標準為少于5個單菌落或通過接種造成的微弱的薄霧狀生長視為陰性，陰性出現最低濃度為MIC值。以MIC值位于CLSI規定的敏感(sensitive，S)、中介(intermediate，I)、耐藥(resistance，R)折點值范圍判斷結果。質控菌株選用大腸埃希菌ATCC 25922。

1.2.6 耐藥基因檢測 根據Sun等[9]報道設計引物，PCR擴增氨基糖苷類、喹諾酮類、β-內酰胺類、氟苯尼考和多黏菌素等25種耐藥基因。PCR反應體系25 μL：2×PCR Premix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/mL)各0.5 μL，模板DNA 1.0 μL，滅菌ddH2O補足體系。PCR擴增產物使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，將鑒定正確的PCR產物送往吉林省庫美生物科技有限公司進行測序，確認目的基因。

2 結 果

2.1 菌株分離鑒定

6株分離菌株在麥康凱瓊脂培養基上形成“奶油狀”、濕潤、圓形的菌落(圖1)，分別命名為K1、K2、K3、K4、K5、K6。生化鑒定結果顯示， 6株分離菌的生化特性與肺炎克雷伯菌相似。菌株在動力半固體培養基中無動力，氧化酶陰性，尿素酶、V-P試驗、西蒙氏枸櫞酸鹽和賴氨酸脫羧酶鑒定均為陽性，靛基質、MR鑒定均為陰性，分解葡萄糖產氣(表2)。分離菌株khe基因PCR擴增結果發現，獲得了長度約為428 bp單一、特異性的條帶(圖2)，與預期長度相符。通過序列比對結果表明，分離得到的6株菌株均為肺炎克雷伯菌。

圖1 分離菌株菌落形態

表2 分離菌株生化鑒定

1～6，樣品PCR產物;M，DL2000 DNA Marker；

2.2 MLST分型

通過MLST分型方法表明，6株肺炎克雷伯菌株分為6種ST型，分別為：ST2594、ST1782、ST2844、ST2330、ST86和ST661(表3)。

表3 菌株MLST分型

2.3 致病性分析

在接種菌液12 h后小鼠開始出現被毛粗亂、行動遲緩、精神沉郁等癥狀；在接種菌液24 h后小鼠開始陸續死亡，48 h后試驗組小鼠全部死亡，對照組小鼠未出現任何癥狀，生存曲線結果見圖3。剖檢死亡小鼠可見肝臟、脾臟和肺臟均有不同程度的出血點，同時從死亡小鼠的臟器組織中均能分離到肺炎克雷伯菌。

圖3 小鼠生存曲線

2.4 血清型及毒力基因檢測結果

以6株肺炎克雷伯菌DNA為模板檢測7種毒力較強的血清型和11種毒力基因，檢測結果見表4。由表4可知，共檢測出6種毒力基因，分別為：fimH、ureA、uge、wabG、kfuBC和allS，7種血清型均未檢測到。

表4 菌株毒力基因檢測結果

2.5 藥物敏感性分析

選用臨床常用的18種抗菌藥物對6株肺炎克雷伯菌進行藥物敏感性試驗，結果見表5。由表5可知，6株菌株對頭孢西丁、頭孢他啶、阿米卡星、亞胺培南和美羅培南均表現為較強的敏感性；對青霉素、卡那霉素、環丙沙星和恩諾沙星均表現為耐藥；對鏈霉素和氟苯尼考的耐藥率為83.3%(5/6)，對氨芐西林、頭孢曲松、慶大霉素及多西環素的耐藥率為66.7%(4/6)，對頭孢噻呋的耐藥率為50.0%(3/6)，對左氧氟沙星和多黏菌素B的耐藥率為16.7%(1/6)。

表5 肺炎克雷伯菌藥物敏感性試驗結果

2.6 耐藥基因檢測結果

以6株肺炎克雷伯菌DNA為模板，采用PCR方法檢測氨基糖苷類、喹諾酮類、β-內酰胺類、氟苯尼考和多黏菌素等25種耐藥基因，菌株耐藥基因攜帶情況見表6。由表6可知，共檢測出18種耐藥基因，主要包括β-內酰胺類耐藥基因blaSHV、blaTEM-1和blaCTX-M-1G；氨基糖苷類耐藥基因aadA1、aac(3’)-Ⅳ、aac(3’)-Ⅱc、aph(4’)-Ⅰa、aph(3’)-Ⅶ，aph(3’)-Ⅳ,aph(2’)-Ⅰb和rmtB；喹諾酮類耐藥基因qnrB、qnrD、qnrS、qepA和oqxAB；氟苯尼考耐藥基因floR；多黏菌素類耐藥基因mcr-1。

表6 菌株藥物敏感性及耐藥基因檢測結果

3 討 論

肺炎克雷伯菌是致使醫院和社區內感染的常見病原菌之一，可引起呼吸、泌尿等多系統的感染。目前，抗生素是治療肺炎克雷伯菌感染的最主要手段之一，臨床上用于治療肺炎克雷伯菌感染的抗菌藥主要有β-內酰胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類、碳青霉烯類及多黏菌素。由于抗生素長期、大量、不規范地使用，致使菌株在藥物的選擇壓力作用下產生耐藥性。 近年來，隨著多耐藥菌和泛耐藥菌的出現，耐藥率呈現逐漸升高的趨勢，肺炎克雷伯菌的耐藥問題也越來越嚴重。同時，毛皮動物細菌耐藥性問題也日趨嚴重，應給予高度重視[10-11]。

本試驗分離得到6株水貂源肺炎克雷伯菌，經MLST分型可知6株菌株具有6種ST型，表明肺炎克雷伯菌的流行存在一定的分子差異。目前，關于水貂肺炎克雷伯菌ST型流行性的報道較少。楊帆等[12]對67株動物源肺炎克雷伯菌進行MLST分析表明，全部菌株共分成17個ST型，其中雞源菌株有5個(ST235、ST37、ST2019、ST2021、ST726)，豬源菌株有6個(ST258、ST11、ST270、ST106、ST1863、ST263)，兔源菌株有4個(ST17、ST148、ST60、ST168)，犬源菌株有3個(ST11、ST65、ST74)。據研究報道，ST258型為歐美國家主要流行的分子型，ST37型是雞群中主要流行的分子型，ST11型為國內醫院感染肺炎克雷伯菌的主要流行的分子型[13-14]。本試驗6株肺炎克雷伯菌雖然為同一養殖場送檢的樣品，但主要表現為6種ST型，該現象十分罕見，可能是因為水貂肺炎克雷伯菌存在特有的ST型，又或是這些菌株很可能來源于人，經過人類的活動或環境傳播到動物。莢膜多糖是肺炎克雷伯菌的主要毒力因子，其中K1、K2、K3、K5、K20、K54和K57型是毒力較強的血清型。另外，肺炎克雷伯菌感染動物與其自身攜帶的致病因子關系密切[15]。本試驗中分離菌株均檢測到毒力基因，且每株菌株都攜帶至少4種毒力基因，檢出率較高；7種血清型均未檢測到，說明6株分離菌株的致病力主要與攜帶的毒力基因有關。

近年來，關于毛皮動物肺炎克雷伯菌的研究逐漸增多。孫虎芝等[16]對從山東地區分離得到的水貂肺炎克雷伯菌進行藥敏檢測，結果表明，菌株對諾氟沙星、頭孢吡肟、阿米卡星、磷霉素、左氟沙星、頭孢他啶、大觀霉素、環丙沙星、氯霉素、多黏菌素B及頭孢西丁敏感；對氨芐西林、卡那霉素、紅霉素、林可霉素、四環素、頭孢噻吩、頭孢呋辛、頭孢唑啉及青霉素G耐藥。韓坤等[17-18]研究結果表明，不同年份分離得到的菌株的藥物敏感性不盡相同，2015年從山東地區分離的10株菌株對氨基糖苷類、青霉素類、三代頭孢菌素類、喹諾酮類及磺胺類抗菌藥的耐藥性較高，但對阿莫西林/克拉維酸、亞胺培南及多黏菌素等抗生素敏感；2018年從河北地區分離的1株菌株對單環內酰胺類、氯霉素類、氨基糖苷類、四環素類、磺胺類及大部分頭孢類耐藥，但對阿米卡星、阿莫西林/克拉維酸、頭孢他啶和亞胺培南敏感。朱利霞等[19]對從河北昌黎分離得到的1株水貂肺炎克雷伯菌進行藥物敏感性檢測發現，菌株對頭孢曲松、阿米卡星、恩諾沙星敏感，對卡那霉素，頭孢拉定、氨芐西林、阿莫西林、青霉素、多西環素、恩諾沙星、林可霉素和復方新諾明耐藥。本試驗中菌株藥敏結果與以上研究結果略有不同，表明不同年份不同地區菌株的耐藥情況也不同，主要是由各養殖場用藥方案不同導致的。因此，為減少耐藥菌株的產生，必須制定有效的防控措施，合理應用抗生素。

細菌的耐藥機制包括多種，耐藥基因是其中最為常見的一種機制。韓坤等[17]從分離得到的10株肺炎克雷伯菌中檢測到耐藥基因blaTEM、blaSHV和blaCTX- M；朱利霞等[20]從毛皮動物肺炎克雷伯菌中檢測出blaTEM、aadA1、gyrB、gyrA、blaSHV-1、sul1、sul2、sul3、blaROB-1、tetA和tetD基因；張傳美等[21]從貂源肺炎克雷伯菌中檢測出aac(3’)-Ⅱ、blaTEM、blaSHV、blaCTX-M-8、qnrS、aac(6’)-Ⅰb和aac(2)基因。本試驗共檢測出18種耐藥基因，且多數為質粒介導的耐藥基因，與以上研究有共同的耐藥基因。質粒是一種能夠自主復制的染色體外DNA分子，它是捕捉、積累和傳播抗菌藥物耐藥性決定基因的重要載體，可以攜帶對β-內酰胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類、四環素類、氯霉素、磺胺類、甲氧芐啶類、大環內酯類、多黏菌素類和碳青霉烯類抗菌藥物產生耐藥的基因在細胞內外進行交換形成新的重組質粒[22-26]。因此，質粒在耐藥基因積累和水平傳播方面發揮著重要作用。監測質粒攜帶的耐藥基因對指導臨床治療、預防和控制耐藥基因的水平傳播具有重要意義。

4 結 論

本研究從患有肺炎的病死水貂中分離得到6株肺炎克雷伯菌，可分為6個ST型；6株分離菌株均可引起小鼠死亡，并攜帶多種毒力基因；至少對7種抗菌藥物表現為耐藥，主要呈現為多重耐藥現象。同時分離菌株攜帶18種耐藥基因，其中包括β-內酰胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類、氟苯尼考和多黏菌素類耐藥基因，且多數耐藥基因為質粒介導的耐藥基因，其可引起細菌耐藥性的快速傳播，從而增強細菌的耐藥性。