4種清熱解毒復方中草藥體外抑菌及抗PRRSV活性研究

孫 璐，張 靜，尹 苗,2，程耀蝶，代 錕，吳 倩,2，趙 洪,2，陳希文,2

(1.綿陽師范學院，動物疫病防控與健康養殖工程技術研究中心，綿陽 621000；2.四川生豬重大疫病監測與防控工程研究中心，綿陽 621000)

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的以發熱、厭食、妊娠母豬出現流產、死胎等為主要癥狀的疫病。隨著養殖業的快速發展，該病的患病幾率也日益增長，PRRS癥狀復雜，難以控制[1]，一旦感染了PRRSV，扁桃體、上呼吸道及肺臟的巨噬細胞、單核細胞等會被破壞，造成肺損傷和機體免疫抑制，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌等病菌入侵機體導致豬死亡的風險就會大大增加，給養殖業造成嚴重危害。目前用于防制PRRSV的主要措施是接種疫苗，主要有滅活苗和弱毒苗兩種[2]，但兩種疫苗的臨床效果均不理想。因此，篩選有效的抗PRRSV和抑菌的藥物是控制PRRSV的重要途徑。

中草藥屬于純天然產物，可以在不傷害機體的前提下直接殺死細菌和抑制病毒，不易產生耐藥性，對機體毒副作用小[3]。大腸桿菌病、金黃色葡萄球菌病和PRRS均屬于外感溫熱病范疇，因動物所患疾病通常是由細菌和病毒混合感染引起，所以中藥的聯合使用及使用復方成為了必然[4]。瀉心湯、黃連解毒湯、三黃虎杖湯及清瘟敗毒散在方劑中屬于清熱解毒類，現代的藥理學研究初步證明了清熱解毒復方中草藥具有多種作用，可以抗病毒、調節免疫功能及抗菌等[5-6]。本試驗探究了4種清熱解毒復方中草藥抗PRRSV和體外抑菌活性，以期為臨床應用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 中草藥

黃芩(山西，批號：201004)、黃柏(四川，批號：20081405)、梔子(四川，批號：200708)、青黛(福建，批號：190102813)、荊芥(四川，批號：200701)、防風(內蒙古，批號：200222)、羌活(四川，批號：201201)、大黃(四川，批號：202008104)、黃連(四川，批號：202011076)、虎杖(湖北，批號：B806251-01)均購自綿陽高新區凱立大藥房。4種清熱解毒復方組分及比例見表1。

表1 4種清熱解毒復方組成

1.2 主要試劑及儀器

LB培養基、平板計數瓊脂(PCA)、0.25%胰蛋白酶、低血清培養基等均購自綿陽市匯億鑫科技有限公司；One Step PrimeScript Ⅲ RT-qPCR Mix、RNase-free ddH2O均購自寶生物工程(大連)有限公司。

CO2培養箱購自賽默飛世爾(蘇州)儀器有限公司；核酸提取儀購自濟凡生物科技(常州)有限公司；倒置顯微鏡(Nikon)、旋轉蒸發儀均購自上海亞榮生化儀器廠；熒光定量PCR分析儀購自杭州博日科技股份有限公司；振蕩培養箱購自上海知楚儀器有限公司。

1.3 供試細菌和病毒

標準菌株大腸桿菌ATCC 25922、金黃色葡萄球菌ATCC 25923、PRRSV均由綿陽師范學院動物疫病防控與健康養殖工程技術研究中心保存。

1.4 中草藥提取

稱取干燥后的單味中草藥各50 g，加入500 mL蒸餾水，浸泡30 min后煎煮，沸騰后保持微沸狀態煎煮1 h[7]，8層醫用紗布過濾；濾渣中加入300 mL蒸餾水，煎煮至沸騰后再保持微沸30 min，合并2次水煎提取的濾液；將濾液蒸發濃縮直至成為浸膏，再將浸膏烘干、粉碎。按4種復方的配比配制成初始濃度為250 mg/mL的藥液，高壓蒸汽滅菌鍋121 ℃滅菌15 min[8]，4 ℃保存備用。

1.5 體外抑菌試驗

1.5.1 菌懸液制備 將保存的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌活化后，接種于LB肉湯培養基，37 ℃培養18～24 h[9]。用生理鹽水稀釋細菌濃度直至108CFU/mL，作為試驗所需濃度。

1.5.2 體外抑菌活性的測定 每15支EP管為一組。在2～14號管中各加入500 μL無菌LB肉湯，1號管中加入1 000 μL 250 mg/mL的藥液，取出500 μL加入2號管，吹打混勻，重復操作，直至12號，依次獲得62.50、31.25、15.63、7.81、3.90、1.95、0.98、0.49、0.24、0.12 mg/mL的藥液，在1～12號管中每管加入50 μL 108CFU/mL的菌懸液；13號管作為空白對照，14號管中加入50 μL菌懸液作為陽性對照，15號管中加入500 μL藥液和50 μL生理鹽水作為陰性對照，渦旋混勻，37 ℃振蕩培養24 h后觀察混濁程度。將藥液和細菌的混合液每個濃度取2 μL點樣于LB平板上，每一組點樣3個平板作為對照，肉眼觀察LB平板是否有細菌生長，將無菌生長的最小濃度作為該中草藥的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)[10]。

選出無菌生長的濃度，吸取菌藥液100 μL涂布于平板計數瓊脂上，設置3個平行對照，37 ℃恒溫培養18～24 h后對平板進行計數[11]，3個平行對照取平均值，以菌落總數<5的最低濃度作為該中草藥的最小殺菌濃度(minimum bactericidal concentration，MBC)[12]。

1.6 體外抗PRRSV試驗

1.6.1 復方中草藥對Marc-145細胞最大安全濃度的測定 用細胞維持液將復方中草藥從初始濃度250 mg/mL二倍倍比稀釋到2-10，依次加到長成單層Marc-145細胞的96孔細胞培養板上，每孔100 μL，各稀釋度均重復4孔，設置細胞對照[13]。在37 ℃、5% CO2培養箱中培養72 h，將96孔細胞板放在倒置顯微鏡下觀察細胞病變情況[14]，以4孔均不出現病變為最大安全濃度[15]。

1.6.2 病毒半數組織培養感染劑量的測定 將待測病毒進行10倍稀釋，直至10-6，加到長滿單層Marc-145細胞的96孔細胞培養板上，每孔100 μL，每個稀釋度重復8孔，在37 ℃、5% CO2培養箱中培養5 d，通過Reed-Muench法計算病毒液的半數組織培養感染劑量(median tissue culture infective dose,TCID50)[16]。

距離比例=(高于50%的病變率-50%)/(高于50%病變的病變率-低于50%的病變率)

TCID50=高于50%病變的病毒最高稀釋度的對數+距離比例

1.6.3 中草藥對病毒吸附細胞的阻斷作用 以復方最大安全濃度為初始濃度，用細胞維持液二倍倍比稀釋復方后，加在長滿單層細胞的細胞培養板中，每孔100 μL，每個稀釋濃度重復4孔，37 ℃培養4 h后棄去原液；每孔中再加入100 μL 100 TCID50的病毒液，培養2 h[17]，棄去液體；每孔加入100 μL維持液，培養72 h，設置病毒對照。

1.6.4 中草藥對病毒合成復制的抑制作用 在長成單層Marc-145細胞的96孔細胞培養板中加入100 μL 100 TCID50病毒液，37 ℃吸附2 h；加入不同稀釋度的中草藥稀釋液，每孔100 μL，重復4孔，37 ℃培養4 h后[17]，棄去原液；加入100 μL維持液，培養72 h，設置病毒對照。

1.6.5 中草藥對病毒的直接殺滅作用 將不同稀釋度的中草藥與等體積的100 TCID50病毒液混合，加到96孔細胞培養板上，37 ℃作用4 h，棄去混合液；加100 μL維持液，培養72 h[18]，重復4孔，設置病毒對照。

1.6.6 實時熒光定量RT-PCR檢測 通過自動核酸提取儀提取病毒RNA，參考路斌等[19]設計引物和探針，上游引物：5′-GCTAGGCCGCAAGT-ACATWC-3′；下游引物：5′-ATCATTTGCCGC-AATCG-3′；探針：5′-CCCCTGCCCACCACGTY-GECLIPSE-3′。引物及探針均由北京華大基因研究中心合成。

PCR反應體系15 μL：One Step PrimeScript Ⅲ RT-qPCR Mix 7.5 μL，上、下游引物及探針各0.5 μL，RNase-free ddH2O 4 μL，RNA模板2 μL。PCR擴增程序：52 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個循環。檢測結果成立的標準是陽性對照FAM熒光Ct值<38，陰性對照無信號。若中草藥復方對病毒無抑制作用，則樣品中會含有病毒核酸，導致出現Ct值和特異的擴增曲線；若中草藥復方對病毒有抑制作用，則樣品中無病毒核酸，不會出現Ct值和特異擴增曲線，從而得出中草藥抗病毒效果。

2 結 果

2.1 4種復方中草藥的體外抑菌活性

由表2可知，4種復方中草藥的體外抑菌活性差異較大，其中瀉心湯對大腸桿菌的抑菌活性最強，MIC和MBC均為7.81 mg/mL；其次是黃連解毒湯和三黃虎杖湯，黃連解毒湯MIC為31.25 mg/mL，MBC為62.50 mg/mL，三黃虎杖湯MIC為62.5 mg/mL，MBC為125 mg/mL；清瘟敗毒散對大腸桿菌沒有明顯的抑制效果。 瀉心湯、黃連解毒湯和三黃虎杖湯對金黃色葡萄球菌的體外抑菌活性較好，瀉心湯和三黃虎杖湯的MIC均為0.24 mg/mL，MBC均為0.49 mg/mL；黃連解毒湯的MIC為0.49 mg/mL，MBC為0.98 mg/mL；清瘟敗毒散的體外抑菌活性較差，MIC和MBC均為125 mg/mL。

表2 4種復方中草藥對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的體外抑菌活性

2.2 4種復方中草藥在Marc-145細胞上的最大安全濃度

觀察細胞病變情況，結果表明，黃連解毒湯對細胞的毒害性最小，最大安全濃度為3.90 mg/mL，其次為清瘟敗毒散(表3)。

表3 4種復方中草藥在細胞上的最大安全濃度

2.3 PRRSV的TCID50

經過5 d的培養，稀釋度在10-3至10-4時，50%的細胞孔出現了病變；當稀釋度為10-1和10-2時，全部的細胞孔均出現病變；當稀釋度為10-3時，8個細胞孔中有5個細胞孔發生了細胞病變，當稀釋度10-4時，8個細胞孔中只有3個細胞孔發生病變，利用Reed-Muench法計算出PRRSV的TCID50為10-3.6(表4)。

表4 PRRSV的TCID50

2.4 4種復方中草藥的抗病毒試驗

實時熒光定量PCR結果顯示，陽性對照的Ct值為32.18，3種作用下不同復方中草藥抗病毒結果見表5。由表5可知，阻斷作用中，瀉心湯在1/4和1/8最大安全濃度都出現了病毒Ct值，分別為36.80和35.02，而在最大安全濃度和1/2最大安全濃度下無Ct值，說明在1/2最大安全濃度(0.24 mg/mL)下，瀉心湯對PRRSV有阻斷作用，三黃虎杖湯在0.12 mg/mL有阻斷效果，黃連解毒湯和清瘟敗毒散均在0.98 mg/mL對PRRSV有較好的阻斷作用；4種復方中草藥對病毒的抑制作用和直接殺滅作用都未出現Ct值，說明4種復方中草藥對PRRSV的抑制作用和直接殺滅作用較好。

表5 4種復方中草藥抗病毒作用

3 討 論

大腸桿菌病、金黃色葡萄球菌病和PRRS是養殖中常見的疾病，都屬于外感溫熱病范疇，治療則以清熱解毒中草藥為主。瀉心湯具有瀉火解毒、燥濕泄熱的作用[20-21]；黃連解毒湯主治火熱實證[22]，主要用于清熱解毒[23]；三黃虎杖湯主要具有清熱解毒、活血化瘀的功能，清瘟敗毒散能清熱解毒、瀉火通便[24]，所以本試驗選取了這4種組方較為簡單的復方中草藥進行體外的抑菌抗病毒研究。

在抑菌方面，中藥的一些成分能直接破壞細菌最外面的細胞膜和細胞壁，導致細菌自身的代謝出現紊亂，達到在體外抑制致病菌的效果[25]。王鈺雄等[26]研究中瀉心湯對普通耐藥金黃色葡萄球菌的MIC為0.3125 mg/mL，與本試驗中瀉心湯對金黃色葡萄球菌的結果相近，可能是因為大黃、黃連、黃芩3種中草藥都有一定的抑菌效果[27]，大黃中含有的大黃酸、黃芩中含有的黃芩素均能夠使細胞通透性增大，造成細菌細胞內容物流出，最終導致致病菌死亡[28]。本試驗中黃連解毒湯對大腸桿菌抑菌活性MIC和MBC分別為31.25和62.5 mg/mL，與呂顏枝等[29]研究黃連解毒湯對雞大腸桿菌的MIC為250 mg/mL結果相近。耿梅英等[30]研究發現，清瘟敗毒散提取液對金黃色葡萄球菌ATCC 25923的MIC為8 mg/mL，抑菌效果較好，其所用的清瘟敗毒散主要藥物為黃連、金銀花、連翹、甘草、丹皮，而本研究中的清瘟敗毒散組方與之不同，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑制效果較差。可能是因為本試驗采用的是最為傳統的水煎法，但是有些中藥成分是不溶于水的，熱穩定性也不好，所以提取出的有效成分有限，而這些有效成分之間產生了頡頏作用，導致其抑菌效果較差。

在抗病毒方面，4種復方中草藥主要成分為黃連和黃芩，黃連主要成分為生物堿，具有清熱解毒、抗菌、抗病毒等作用；黃芩有效成分為黃芩苷、黃芩素等黃酮類物質，具有除熱、抗炎及抗菌等功效[31]。4種復方中草藥對病毒均有阻斷作用，可能是因為其中的多糖、三萜類等生物活性成分干擾病毒蛋白和RNA的合成或與病毒直接結合，抑制病毒復制或破壞其結構有關。研究發現，大黃、黃柏等單味中藥可以直接抗病毒[32]；黃芩具有抗PRRSV的作用[33]；黃連的提取液可以抑制RNA聚合酶發揮抗病毒的作用[34]，均與本研究結果相近。4種復方中草藥的抑制作用和直接殺滅均較好，可能是因為單味中藥之間產生協同效應，復方可以通過抑制病毒的黏附、合成等機制發揮抗病毒作用[35]。但是4種復方中草藥的組分均非單一活性成分，起關鍵作用的是哪一成分或是多靶點協同的抗病毒作用有待進一步研究[36]。冼瓊珍等[37]研究發現，黃芩、黃連及黃柏對PRRSV有較好的阻斷作用，其中黃芩和黃連的抑制作用比阻斷作用好，但是黃柏和黃連幾乎對PRRSV沒有直接滅活的作用。唐耀平等[38]研究發現，清瘟敗毒散對高致病性PRRSV的預防和治療的有效率達75%。本試驗結果表明，4種復方中草藥在體外的抗病毒效果均較好，但中藥中能夠抗病毒的成分很少[39]，所以還需要進行更深入的研究。

本研究采用傳統方法提取4種清熱解毒復方中草藥活性成分，以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和PRRSV作為病原體在體外進行了抑菌抗病毒試驗并取得了良好效果，但由于中草藥成分復雜，相關作用機制研究有限，且進入機體內后還會受到溫度、pH、作用部位及宿主健康狀況等多種因素影響，因此若要實現中藥普及應用于獸醫臨床還需要進一步深入的研究。

4 結 論

本研究結果表明，4種清熱解毒復方中草藥中瀉心湯體外抑菌及抗PRRSV的效果最好，其次是三黃虎杖湯、黃連解毒湯和清瘟敗毒散，4種清熱解毒復方均有一定的體外抑菌和抗病毒活性，該研究結果可為豬場臨床用藥提供一定參考。