豬瘟病毒E2-GM-CSF融合蛋白在HEK293T細胞中的表達和免疫原性分析

張艷敏，周亞南，曹 磊，田 園，劉旭平，譚文松，趙 亮

(1.華東理工大學,生物反應器工程國家重點實驗室，上海 200237；2.上海倍諳基生物科技有限公司，上海 201203)

豬瘟(classical swine fever,CSF)是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的豬的高傳染性、高致病性疾病，嚴重危害動物健康和養豬業[1-2]。CSFV屬于黃病毒科(Flaviridae)瘟病毒屬(Pestivirus)，有4種結構蛋白(C、E0、E1和E2)[3]。其中，E2蛋白是CSFV的主要保護性抗原，可誘導機體產生針對CSFV的中和抗體，是研究各種CSFV基因工程疫苗的首選靶蛋白[4]。CSF的防控措施主要是清除政策和預防性疫苗接種，但因清除政策在高密度養豬區會造成巨大的經濟損失，所以在除歐盟外的許多國家仍使用預防性疫苗接種防控CSF[5-6]。目前可用的CSFV疫苗有減毒活疫苗、亞單位疫苗和嵌合疫苗，應用最廣泛的是減毒活疫苗。這3類疫苗均有一定的局限性，如減毒活疫苗不能從血清學上區分豬群中的疫苗接種豬和野毒感染豬(differentiation of infected from vaccinated animals,DIVA)，給CSF的控制和凈化帶來了挑戰；嵌合疫苗在DIVA鑒定診斷方面會受到牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)和邊界病毒(Border disease virus,BDV)的交叉反應影響，樣品檢測的特異性低；而E2亞單位疫苗除了具有DIVA特性外，還具有安全性好、穩定性強、便于運輸和儲存等優點，是防控CSF的有效措施[7]，但E2亞單位疫苗的免疫原性較低，不能提供完全保護[8-9]。因此，為了預防和控制CSF，開發安全有效的新型CSFV標記疫苗十分必要。近年來，已有學者利用不同的表達系統對E2亞單位疫苗進行表達研究，如大腸桿菌表達系統[10]、酵母表達系統[11]和桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統[12]等，但E2亞單位疫苗的免疫原性并沒有明顯提高。為進一步開發E2亞單位疫苗，將E2蛋白與分子佐劑結合、使用改良佐劑的E2乳劑及使用流行株的E2蛋白等多種途徑被嘗試用于提高E2蛋白免疫原性[8]。細胞因子是參與免疫發展和調控的關鍵分子，已在一些治療性和預防性疫苗中作為分子佐劑來提高抗原免疫效力[13-14]。其中，粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)在先天免疫和適應性免疫反應中有廣泛的調節作用，如募集抗原遞呈細胞(antigen-presenting cells,APCs)到抗原加工位點，增強抗原特異性CD8+T細胞反應等[13]。研究表明，GM-CSF可作為免疫佐劑增強抗原的免疫原性[15-16]。因此，在表達CSFV E2蛋白的同時表達GM-CSF，有望提高E2蛋白的免疫原性，增強免疫反應。CSFV的宿主細胞是哺乳動物細胞，用哺乳動物細胞表達CSFV E2蛋白更有利于其形成天然構象和合適的糖基化形式[17]。本研究通過構建穩定表達E2-GM-CSF融合蛋白的HEK293T重組細胞，實現E2-GM-CSF融合蛋白在哺乳動物細胞中的表達，并通過小鼠免疫試驗分析E2-GM-CSF融合蛋白的免疫原性，以期為CSFV亞單位疫苗開發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

HEK293T細胞(編號：CRL-3216)購自美國模式培養物集存庫(American type culture collection,ATCC)；慢病毒表達載體pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-puro(pCDH)購自SBI公司；慢病毒包裝質粒pMD2.G和psPAX2均購自ThermoFisher Scientific公司；DNA Marker、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、細胞基因組DNA提取試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司；嘌呤霉素鹽酸鹽和BCA蛋白濃度測定試劑盒均購自上海碧云天生物技術公司；His-TrapTMexcel預裝柱購自GE公司；CSFV抗原檢測ELISA試劑盒購自Median公司；Montanide ISA61佐劑購自SEPPIC公司。4～6周齡健康BALB/c雌鼠購自杭州華安生物技術有限公司。

1.2 重組慢病毒表達載體的構建

為了使E2蛋白分泌表達，去除其C-端胞內區和跨膜區的蛋白，同時在其C-端加入6個組氨酸標簽以便于純化。合成符合上述要求的CSFV 石門株E2基因(GenBank登錄號:AF092448.2)和豬GM-CSF基因(GenBank登錄號:AAB06854.1)并克隆至pGH載體構建pGH-E2和pGH-GM-CSF質粒。以pGH-E2和pGH-GM-CSF質粒為模板PCR擴增E2、E2-F和GM-CSF DNA序列(引物信息見表1)，其中E2-F片段是在E2基因的5′-端加上與GM-CSF基因3′-端同源的序列。以E2-F和GM-CSF為模板，F1和R3為引物通過重疊PCR(Overlap PCR)擴增E2-GM-CSF基因。將E2和E2-GM-CSF基因與pCDH載體連接，連接產物轉化大腸桿菌Stabl3感受態細胞，經EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切和測序鑒定，重組質粒命名為pCDH-E2和pCDH-E2-GM-CSF。

表1 引物信息

1.3 重組慢病毒包裝

將HEK293T細胞接種至6孔板，置于細胞培養箱中培養24 h，用新鮮培養基替換原培養基。配制DNA-轉染試劑混合物：向DMEM培養液中加入pCDH-E2、pCDH-E2-GM-CSF或pCDH對照質粒和慢病毒包裝質粒pMD2.G和psPAX2，再加入Lipo8000TM轉染試劑，混勻后加至上述6孔板，繼續培養72 h，收集培養上清，經濾膜過濾后，于-80 ℃保存。

1.4 重組細胞的構建和鑒定

分別用pCDH對照、E2和E2-GM-CSF慢病毒顆粒轉導HEK293T細胞，經嘌呤霉素加壓篩選后，獲得HEK293T-pCDH對照細胞及HEK293T-E2和HEK293T-E2-GM-CSF重組細胞。將重組細胞接種至6孔板，培養120 h，收集細胞提取基因組DNA進行PCR驗證；收集培養上清通過ELISA和Western blotting檢測E2蛋白和E2-GM-CSF融合蛋白。設計并合成引物對基因組DNA進行PCR驗證。引物序列為：上游引物：5′-CGCAAATGGG-CGGTAGGCGTG-3′；下游引物：5′-GGCACCGG-AGCGATCGCAGATC-3′。以基因組DNA為模板PCR擴增E2和E2-GM-CSF片段，產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測。用CSFV抗原ELISA試劑盒檢測培養上清中E2蛋白的表達，根據樣品(sample)D450 nm值同陽性對照(positive)D450 nm值比較后得到的SP值(sample/positive),判斷樣品中蛋白的結果；以鼠抗豬GM-CSF單克隆抗體作為一抗，HRP標記的羊抗鼠IgG為二抗,Western blotting分析E2-GM-CSF融合蛋白。

1.5 重組蛋白的純化

離心收集HEK293T-E2和HEK293T-E2-GM-CSF細胞培養上清，經濾膜過濾除雜，用His-TrapTMexcel柱進行蛋白純化，用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測純化蛋白濃度。純化后蛋白用10% SDS-PAGE膠分離，經考馬斯亮藍染色、純水脫色后觀察蛋白條帶。

1.6 亞單位疫苗制備和免疫原性分析

將純化后的E2蛋白、E2-GM-CSF融合蛋白和PBS與Montanide ISA61佐劑以2∶3比例混合制成疫苗。將4～6周齡BALB/c雌鼠隨機分為3組，每組5只。E2組小鼠腹腔注射含25 μg E2蛋白的疫苗，200 μL/只；E2-GM-CSF組小鼠腹腔注射含25 μg E2-GM-CSF融合蛋白的疫苗，200 μL/只；對照組小鼠注射等體積的PBS乳劑。第1次免疫后21 d以相同劑量和相同方式進行第2次免疫。第1次免疫后第0、14、21和28天對免疫鼠采血，用于檢測E2特異性抗體。

1.7 ELISA檢測小鼠血清中的E2特異性抗體

利用間接ELISA方法測定免疫小鼠血清中抗體效價。用包被液稀釋純化的E2蛋白，以4 ng/μL E2蛋白包被96孔酶標板，于4 ℃包被過夜；PBST洗板3次；用含3% BSA的PBST室溫封閉2 h；PBST洗板3次；加入梯度稀釋的待檢血清(血清從1∶300至1∶24 300進行3倍倍比稀釋)，室溫孵育1 h；PBST洗板5次；加入HRP標記的羊抗鼠IgG，置于室溫孵育1 h；PBST洗板5次；加入TMB顯色液，避光顯色10 min；加入硫酸終止顯色，用酶標儀測定450 nm處的吸光值。

2 結 果

2.1 目的基因克隆

分別以pGH-E2和pGH-GM-CSF質粒為模板，PCR擴增E2、E2-F和F-GM-CSF DNA片段，得到大小分別約為1 089、1 157和438 bp 的E2、E2-F和F-GM-CSF條帶(圖1A)。 以純化后的E2-F和F-GM-CSF為模板，用重疊PCR方法擴增E2-GM-CSF融合基因，得到大小為1 515 bp的E2-GM-CSF條帶。表明成功擴增了E2和E2-GM-CSF基因，可用于重組質粒構建。

M，D2000 DNA Marker；1，E2-F片段；2，F-GM-CSF片段；3，E2基因；4，E2-GM-CSF基因

2.2 重組質粒pCDH-E2和pCDH-E2-GM-CSF的雙酶切鑒定

重組質粒pCDH-E2和pCDH-E2-GM-CSF經EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定，結果顯示，分別得到大小為8 172 bp的載體片段及1 112和1 521 bp的E2及E2-GM-CSF基因片段(圖2)。測序結果表明，重組質粒pCDH-E2和pCDH-E2-GM-CSF的目的基因序列正確。

M，D15000 DNA Marker；1，重組質粒pCDH-E2雙酶切；2，重組質粒pCDH-E2-GM-CSF雙酶切

2.3 HEK293T-E2和HEK293T-E2-GM-CSF重組細胞鑒定

在HEK293T-E2和HEK293T-E2-GM-CSF細胞基因組DNA PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖中分別觀察到1 258和1 686 bp的條帶(圖3)，與預期大小相符，證明E2和E2-GM-CSF基因成功整合至細胞基因組DNA。

M，D2000 DNA Marker；1，未處理的HEK293T細胞；2，HEK293T-pCDH對照細胞；3，HEK293T-E2細胞；4，HEK293T-E2-GM-CSF細胞

2.4 重組蛋白的ELISA和Western blotting鑒定

收集重組細胞培養上清，進行ELISA和Western blotting鑒定。ELISA結果顯示，未處理的HEK293T細胞和HEK293T-pCDH對照細胞培養上清SP值遠<20%，未檢測到E2蛋白；HEK293T-E2和HEK293T-E2-GM-CSF細胞培養上清SP值遠>20%，檢測到E2蛋白(圖4)，證明E2蛋白在重組細胞中分泌表達。Western blotting結果顯示，細胞培養上清中檢測到大小約70 ku的E2-GM-CSF融合蛋白(圖5)，說明E2-GM-CSF融合蛋白在重組細胞中分泌表達。

NC，未處理細胞上清；pCDH，HEK293T-pCDH對照細胞上清；E2，HEK293T-E2細胞上清；E2-GM-CSF，HEK293T-E2-GM-CSF細胞上清

圖5 Western blotting檢測培養上清中的E2-GM-CSF融合蛋白

2.5 重組蛋白純化

SDS-PAGE檢測結果顯示，獲得清晰單一的大小分別約為50和70 ku的E2蛋白和E2-GM-CSF融合蛋白條帶(圖6)，說明純化后的E2蛋白和E2-GM-CSF融合蛋白純度較高。

M，蛋白質分子質量標準；1，E2蛋白；2，E2-GM-CSF融合蛋白

2.6 小鼠血清E2特異性抗體檢測

用ELISA檢測免疫小鼠血清中的E2特異性抗體水平，結果見表2。由表2可知，PBS對照組小鼠血清中未檢測到E2特異性抗體；E2組在免疫后14 d檢測到E2特異性抗體，在免疫后28 d抗體效價達到最高值，為1∶1 800；E2-GM-CSF組在免疫后14 d檢測到與E2組相同量的抗體，在免疫后21和28 d抗體效價均高于E2組，最高為1∶8 100，表明HEK293T細胞表達的E2蛋白和E2-GM-CSF融合蛋白均有免疫原性，且E2-GM-CSF融合蛋白的免疫原性更高。

表2 ELISA檢測小鼠血清中的E2特異性抗體效價

3 討 論

E2亞單位疫苗是新型CSFV疫苗的重要研究方向，但與減毒活疫苗相比，由于E2蛋白的免疫原性較低導致E2亞單位疫苗保護效果不理想，所以有必要配合高效的佐劑使用。已有研究表明，細胞因子作為“抗原-細胞因子”融合蛋白疫苗或作為“抗原+細胞因子”混合疫苗給藥時可顯著增強各種抗原的免疫原性，且作為“抗原-細胞因子”融合蛋白疫苗給藥時，細胞因子表現出更好的佐劑活性[18]。GM-CSF是一類能促進早期造血細胞生成并調節成熟中性粒細胞功能的細胞因子，在臨床上對調節免疫功能、促進疫苗的效果有顯著作用。 Liu等[19]研究表明，GM-CSF可通過免疫應答增強HPV16/18疫苗的抗腫瘤作用，證明了GM-CSF的佐劑活性。又因為原核表達的E2蛋白缺乏正確的翻譯后修飾且多為包涵體，而CSFV的宿主是哺乳動物細胞，用哺乳動物細胞表達CSFV E2蛋白更有利于其形成天然構象和合適的糖基化形式。

本研究構建了穩定表達E2-GM-CSF融合蛋白的HEK293T重組細胞，并通過小鼠免疫試驗分析了表達的E2-GM-CSF融合蛋白的免疫原性。利用慢病毒載體構建了表達E2蛋白和E2-GM-CSF融合蛋白的HEK293T重組細胞，實現了重組蛋白在哺乳動物細胞中相對快速的生產。研究表明，E2蛋白缺乏合適的翻譯后修飾，尤其是糖基化時不能誘導可檢測的病毒中和抗體反應和針對CSFV的保護，且CSFV是哺乳動物細胞病毒，GM-CSF也是由哺乳動物細胞表達的細胞因子，所以與其他表達系統相比，哺乳動物細胞表達系統更有利于形成具有正確結構和合適糖基化的E2-GM-CSF融合蛋白[17，20]。Lorenzo等[21]利用HEK293細胞表達了CSFV E2蛋白和豬CD154分子的融合蛋白E2-CD154，發現即使在不同的培養條件下，HEK293細胞表達的蛋白批次間也具有高度的可重復性和一致性。這為用HEK293細胞表達E2蛋白和E2-GM-CSF融合蛋白提供了依據。通過常規質粒轉染技術構建穩定細胞系費時費力，又因質粒在細胞基因組中的隨機整合，使得結果難以預測，而慢病毒傾向于高頻率整合至具有轉錄活性的染色質中，可在細胞中產生更高、更穩定的轉基因表達[22-23]。因此，與質粒轉染構建穩定細胞株相比，本研究用慢病毒載體構建表達E2蛋白和E2-GM-CSF融合蛋白的HEK293重組細胞是相對快速的方法。重組細胞表達的E2蛋白和E2-GM-CSF融合蛋白純化后，通過小鼠免疫試驗分析了其免疫原性。免疫小鼠血清的ELISA結果表明，E2-GM-CSF融合蛋白免疫原性高于E2蛋白。這與倪蒞文等[24]用大腸桿菌表達的E2和GM-CSF融合蛋白的小鼠免疫結果一致，E2和GM-CSF融合蛋白比E2蛋白免疫小鼠后產生的抗體水平更高。而Wang等[25]進行的豬圓環病毒2型Cap蛋白(PCV2-Cap)亞單位疫苗的研究結果表明，Cap-PoGM-CSF融合蛋白免疫小鼠后誘導的PCV2特異性抗體水平與PCV2-Cap蛋白沒有明顯差異，但可引起更強的淋巴細胞增殖反應和更多的白介素-2和干擾素-γ分泌，表明GM-CSF不能增強由PCV2-Cap疫苗誘導的體液免疫，卻可增強由PCV2-Cap疫苗誘導的細胞免疫。GM-CSF在體液免疫中展現不同作用的原因可能是由抗原蛋白本身的特點導致的，也可能與抗原蛋白與GM-CSF形成的融合蛋白的結構有關，具體原因還有待進一步研究。本研究并沒有驗證E2-GM-CSF融合蛋白是否會像Cap-PoGM-CSF融合蛋白一樣引起更強的細胞免疫反應，所以需進行免疫試驗進一步分析，E2-GM-CSF融合蛋白的免疫原性也需進行豬免疫和攻毒試驗進一步評估。

4 結 論

本研究利用慢病毒載體構建了表達E2-GM-CSF融合蛋白的HEK293T重組細胞，可正確表達具有免疫原性的E2-GM-CSF融合蛋白，為預防和控制CSF提供了新型的候選E2亞單位疫苗，并為其他亞單位疫苗在哺乳動物細胞中的表達提供參考。