熱應激對摩拉和尼里-拉菲水牛血液生化指標的影響

劉新勇，譚正準，李 輝，黃 健，羅 華，曾令湖，程雋如，鐘華配，楊春艷，王曉麗，覃廣勝

(1.廣西大學動物科學技術學院，南寧 530005；2.中國農業科學院廣西壯族自治區水牛研究所，南寧 530001)

水牛可分為河流型和沼澤型兩種類型，中國的本土水牛主要是作為役用的沼澤型水牛，摩拉和尼里-拉菲水牛則是從國外引進的產奶性能優良的河流型水牛，目前在南方地區以提高生產性能為目標開展了與本地水牛的雜交改良，對新形勢下南方奶業和現代牧業的發展具有重要意義。氣候變化能對動物生理產生不利影響，導致生產和繁殖效率整體下降并造成巨大的經濟損失，以及引起動物健康和福利等問題[1]。熱應激是指當動物產生的熱負荷超出其散熱能力時機體所做出非特異性反應的總和。夏季熱應激能引起水牛生理功能的一系列變化，包括采食量下降、激素分泌變化，呼吸頻率、脈搏率、直腸溫度升高及出汗、氧化應激增加等。由于水牛汗腺稀少，體表毛發稀疏，皮膚較厚且是黑色，容易吸收熱量，所以當水牛暴露在炎熱的環境條件下時更易受到熱應激影響[2]。目前普遍認為水牛在生理上對熱應激的適應性不如奶牛[3]。Lakhani等[4]和Li等[5]對不同季節摩拉和尼里-拉菲水牛生理反應和代謝相關激素以及氧化狀態進行了研究，證實了熱應激會對水牛生理產生不利影響。本研究旨在探討夏季熱應激和秋季非應激條件下摩拉和尼里-拉菲水牛血液生化指標的變化，通過測定能夠反映機體健康狀況、內分泌系統功能、抗氧化功能、正常生理代謝的生化指標，對比兩種水牛熱應激時體內物質代謝和某些組織器官機能狀態變化及其耐熱性能，為夏季水牛熱應激的相關研究提供數據支持和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及飼養管理

試驗在廣西水牛研究所水牛種畜場進行。選擇體況相近、體重275～300 kg、4～5歲、飼養管理一致的摩拉和尼里-拉菲母水牛各11 頭。試驗期分為熱應激期(2020年7月)和非應激期(2020年11月)兩個階段，試驗期和非試驗期(2020年8月-2020年10月)試驗牛均在同一牛欄飼養，牛欄有運動場和遮陽棚且通風良好，試驗牛可以自由活動且自由采食充足的飼料和飲水。飼糧營養水平參照廣西水牛研究所水牛種畜場飼養標準，飼糧主要由象草、玉米秸稈、啤酒糟、精料補充料等組成，試驗期和非試驗期均保持一致。

1.2 牛舍環境的溫濕指數測定

采用在線揚塵監測系統(深圳市格林福澤環境科技有限公司)實時記錄牛舍環境數據，將8個探頭安裝于牛舍墻壁，高度與動物背部接近，每1 h收集1次牛舍的溫度(T，℃)和相對濕度(RH，%)數據。保證探頭周圍有效通風，防止陽光照射和雨淋，并避免牛觸及。利用牛舍的溫度和相對濕度計算牛舍環境溫濕指數(THI)，THI=0.81×T+(0.99×T-14.3)×RH+46.3。以THI作為水牛熱應激程度的評定標準，當THI≤72為無熱應激；7288為重度熱應激[6]。

1.3 血樣采集及測定指標

每頭試驗牛采血4次，每次間隔1周。采血當天09:00(飼喂前)通過頸靜脈采血10 mL，室溫靜置2 h,待血液凝固后3 000 r/min離心10 min，分離血清分裝到EP管中，于-80 ℃保存待測。

一部分血清樣品送廣西國際壯醫醫院應用日立7020全自動生化分析儀檢測，試劑盒由上海朗頓生物科技有限公司提供,測定指標包括：總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLOB)、谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、谷氨酰基轉移酶(GGT)、總膽固醇(CHOL)、尿素氮(BUN)、甘油三酯(TG)、葡萄糖(GLU)、三碘甲腺原氨酸(T3)、四碘甲腺原氨酸(T4)、鉀(K+)、鈉(Na+)、氯(Cl-)和鈣(Ca2+)離子含量/活性;另一部分血清樣品送江蘇晶美生物科技有限公司采用酶聯免疫分析法(ELISA)檢測，試劑盒由江蘇晶美生物科技有限公司提供,測定指標包括：胰島素樣生長因子1(IGF-1)、牛皮質醇(CORT)、牛瘦素(LEP)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、總抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、熱休克蛋白70(HSP70)和熱休克蛋白90(HSP90)的含量/活性。

1.4 數據統計

試驗數據經Excel 2016初步整理后采用SPSS 26.0軟件進行單因素方差分析，以P<0.05表示差異顯著。試驗結果以平均值±標準差表示。

2 結 果

2.1 牛舍環境溫濕指數

由表1可知，熱應激期牛舍溫度為31.60 ℃，相對濕度為80.13%，THI為85.25，水牛處于中度熱應激；非應激期牛舍溫度為21.11 ℃，相對濕度為88.18%，THI為69.10，水牛處于非應激狀態。

表1 牛舍溫濕指數測定結果

2.2 熱應激期和非應激期的水牛部分血清生化指標比較

由表2可知，摩拉水牛熱應激期的CHOL含量顯著高于非應激期(P<0.05)，ALT和AST活性均顯著低于非應激期(P<0.05)；尼里-拉菲水牛熱應激期的ALB、CHOL、GGT含量均顯著高于非應激期(P<0.05)，GLOB含量顯著低于非應激期(P<0.05)。熱應激期摩拉水牛的ALT活性及TP、GLOB、CHOL、BUN、TG含量均顯著高于尼里-拉菲水牛(P<0.05)，ALB含量顯著低于尼里-拉菲水牛(P<0.05)；非應激期摩拉水牛的ALT活性及BUN、TG、GLU含量均顯著高于尼里-拉菲水牛(P<0.05)。其余生化指標在不同品種以及不同時期差異均不顯著(P>0.05)。

表2 水牛部分血清生化指標測定結果

2.3 熱應激期和非應激期的水牛血清激素含量比較

由表3可知，摩拉和尼里-拉菲水牛熱應激期的IGF-1、CORT、LEP含量均顯著低于非應激期(P<0.05)；尼里-拉菲水牛熱應激期的T3、T4含量均顯著高于非應激期(P<0.05)，T4含量顯著高于熱應激期摩拉水牛(P<0.05)；其余激素指標在不同品種以及不同時期差異均不顯著(P>0.05)。

表3 水牛血清激素含量測定結果

相同指標，同行數據肩標不同大寫字母表示兩個時期間差異顯著(P<0.05)，同列數據肩標不同小寫字母表示兩個品種間差異顯著(P<0.05)，肩標相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同

For the same index，in the same row，values with different capital letter superscripts mean significant difference between two periods (P<0.05),in the same column，values with different small letter superscripts mean significant difference between two breeds (P<0.05)；While with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05).The same as below

2.4 熱應激期和非應激期的水牛血清抗氧化指標比較

由表4可知，摩拉和尼里-拉菲水牛熱應激期的GSH-Px活性及T-AOC均顯著低于非應激期(P<0.05)，MDA和HSP70含量均顯著高于非應激期(P<0.05)；摩拉水牛熱應激期的SOD活性顯著高于非應激期(P<0.05)；其余抗氧化指標在不同品種以及不同時期差異均不顯著(P>0.05)。

表4 水牛血清抗氧化指標測定結果

2.5 熱應激期和非應激期的水牛血清離子含量比較

由表5可知，摩拉和尼里-拉菲水牛熱應激期血清K+含量均顯著高于非應激期(P<0.05)，Ca2+含量均顯著低于非應激期(P<0.05)；摩拉水牛熱應激期的Na+和Cl-含量均顯著高于非應激期(P<0.05)；熱應激期摩拉水牛的K+含量顯著低于尼里-拉菲水牛(P<0.05)；其余離子含量在不同品種以及不同時期差異均不顯著(P>0.05)。

表5 水牛血清離子含量測定結果

3 討 論

3.1 熱應激對水牛部分血清生化指標的影響

血清生化指標可以反映動物機體健康狀況、適應性及生產性能，可作為量化評判個體或群體健康狀況的指標[7]。血清 TP主要包括ALB和GLOB，BUN是蛋白質的代謝產物，蛋白質代謝良好時TP、ALB和BUN含量較低，而GLOB一定程度上可反映機體免疫力狀況[8]。本研究中，熱應激期尼里-拉菲水牛血清ALB含量顯著高于其非應激期，也高于熱應激期摩拉水牛，而GLOB含量則相反，但兩種水牛在兩個時期的TP和BUN含量均無顯著差異。說明熱應激對尼里-拉菲水牛的免疫水平造成了一定影響，但熱應激期摩拉和尼里-拉菲水牛的蛋白質代謝狀況均良好。

ALT、AST和GGT活性均可反映動物機體肝功能狀況，當肝臟受損時，血清中ALT、AST和GGT濃度會升高[9]，且有研究表明GGT在反芻動物中可作為評價肝功能損傷的敏感指標[10]。CHOL可反映肝臟的類脂質代謝功能情況，在肝細胞嚴重受損時，血清中CHOL濃度顯著下降。本研究中，除ALT活性高于默克獸醫手冊[11]正常范圍(6.9～35.3 U/L)外，其他生化指標含量均在水牛正常范圍以內，但熱應激期摩拉和尼里-拉菲水牛的CHOL含量均顯著高于非應激期。說明熱應激雖未對摩拉和尼里-拉菲水牛的肝臟造成不良影響，但對兩種水牛的類脂質代謝功能造成了一定影響。宋小珍等[9]研究發現，錦江黃牛熱應激期和非熱應激期的CHOL濃度不存在顯著差異，與本研究結果不一致，可能是黃牛對熱應激的耐受力更高，其類脂質代謝功能未受到影響。考慮到膽固醇可作為甾體激素合成的原料，未來可結合熱應激對水牛生殖激素影響的研究來進一步探究CHOL能否作為水牛熱應激敏感指標。

TG是血脂的主要成分，主要功能是供給與儲存能量。本研究中尼里-拉菲水牛在兩個時期的BUN和TG含量均顯著低于摩拉水牛。由于試驗牛均處于同一飼養條件，可能是摩拉和尼里-拉菲水牛對不同營養成分的吸收代謝有一定差異導致的，也可能與尼里-拉菲水牛乳脂率(6.3%)低于摩拉水牛(7.6%)有關，摩拉和尼里-拉菲水牛營養代謝方面的對比還需進一步研究。

3.2 熱應激對水牛血清激素含量的影響

IGF-1是一種在肝臟中產生的內分泌激素，能促進骨骼、肌肉和內臟器官的生長[12]。CORT是腎上腺皮質合成分泌的一種類固醇激素，具有動員能源，促進脂類、蛋白質分解和糖異生作用[13]。LEP是主要由白色脂肪組織合成和分泌的蛋白質類激素，能作用于下丘腦的代謝調節中樞，發揮抑制食欲、減少能量攝取、增加能量消耗、抑制脂肪合成的作用[14]。本研究中摩拉和尼里-拉菲水牛在熱應激期血清IGF-1、CORT和LEP含量均顯著低于非應激期，說明熱應激對水牛內分泌系統造成一定影響，機體內分泌系統通過自身調節降低了物質與能量代謝以提高機體對熱應激的適應能力。研究表明，西門塔爾牛熱應激期的IGF-1濃度顯著下降[15]，與本研究結果一致。而廖迎新等[16]研究發現，荷斯坦奶牛熱應激期的CORT濃度顯著上升，可能是品種不同導致的。有關熱應激水牛血液IGF-1、CORT、LEP水平的研究鮮見報道，這3個指標能否作為反映水牛熱應激的敏感指標還需進一步的研究。

T3和T4能夠加速脂肪和糖的代謝，從而增加機體的產熱量。甲狀腺激素的合成和分泌受垂體分泌的促甲狀腺激素(TSH)的控制，其分泌過程與大腦皮層接受外界冷熱刺激有關。研究表明，熱應激可對下丘腦-垂體-甲狀腺軸產生影響，使甲狀腺濾泡縮小并減少T3和T4分泌，進而降低代謝率和減少產熱，以增加機體對炎熱環境的適應[17]。但Mayahi等[18]研究發現，水牛在夏季血清T4含量更高。而Dixit等[19]研究表明，摩拉水牛T3和T4濃度及其比率在不同季節并沒有顯著差異。本研究結果表明摩拉水牛T3和T4濃度在兩個時期沒有顯著差異，而尼里-拉菲水牛熱應激期的T3和T4濃度顯著高于非應激期，說明熱應激期摩拉和尼里-拉菲水牛均具有良好的甲狀腺功能和抗熱應激能力，但尼里-拉菲水牛的代謝和體溫調節能力更強。

3.3 熱應激對水牛血清抗氧化指標的影響

動物機體在正常情況下抗氧化能力與不斷產生氧自由基的氧化能力之間保持著動態平衡，不會造成組織損傷。但當動物受到熱應激影響時，自由基生成異常增多導致組織氧化損傷，并影響機體內環境的相對穩定。動物機體自身具有廣泛的抗氧化防御機制，體內的抗氧化劑和抗氧化酶(如GSH-Px、SOD)都能清除脂質過氧化物及過氧化物中的醛類化合物(如MDA)，從而降低組織的損傷程度。研究表明，熱應激期牛血清GSH-Px、SOD活性和T-AOC均顯著低于非應激期，而血清MDA含量顯著上升[5,15]，說明機體抗氧化能力減弱，抗氧化防御系統無法對抗過量的活性氧(ROS)負荷。本研究中摩拉和尼里-拉菲水牛在熱應激期的GSH-Px和T-AOC活性均顯著低于非應激期，MDA含量顯著高于非應激期。但摩拉水牛熱應激期的SOD活性顯著高于非應激期，GSH-Px活性和T-AOC高于熱應激期尼里-拉菲水牛。說明熱應激對摩拉和尼里-拉菲水牛的抗氧化能力均造成一定影響，GSH-Px活性、T-AOC及MDA含量發生了顯著的變化，但摩拉水牛比尼里-拉菲水牛具有更強的清除自由基能力。

HSP是反映動物舒適度和氣候適應性的重要壓力標志，是一類具有分子伴侶活性的應激信號分子，具有恢復蛋白自然結構、提高機體抗應激能力的作用[20]。研究表明，奶牛和水牛夏季血清HSP70和HSP90含量都較高[21-22]，而Manjari等[23]認為HSP70能夠作為水牛熱應激的生理和細胞特征標志物。本研究中，摩拉和尼里-拉菲水牛熱應激期HSP70含量均顯著高于非應激期，而熱應激期HSP90含量與非應激期之間沒有顯著差異。與劉深賀[24]研究中雜交水牛夏季血漿HSP70(421.28 pg/mL)和HSP90含量(3 348.48 pg/mL)均顯著高于冬季HSP70(174.11 pg/mL)和HSP90含量(947.21 pg/mL)的結果相比，本試驗HSP70的結果與其相符且含量更高，而HSP90的結果與其不一致，說明水牛血清HSP70比HSP90對熱應激更敏感。

3.4 熱應激對水牛血清離子含量的影響

血清離子在維持機體正常生理代謝和內環境穩定方面具有重要的作用，且對應激反應中激素的合成和分泌、能量代謝、蛋白質合成、抗氧化以及免疫功能發揮都有重要作用[25]。本研究中，摩拉和尼里-拉菲水牛在熱應激期血清K+含量均顯著高于非應激期，摩拉水牛熱應激期的Na+含量顯著高于非應激期。這與廖迎新等[16]研究熱應激對荷斯坦奶牛血液微量礦物元素影響的結果基本一致，其原因可能與熱應激加劇新陳代謝，加強了礦物質活動有關。本研究中，摩拉水牛熱應激期的Cl-含量顯著高于非應激期，而摩拉和尼里-拉菲水牛熱應激期的Ca2+含量均顯著低于非應激期。其原因可能是熱應激時水牛呼吸頻率加快，血液CO2濃度下降，造成呼吸性堿中毒，機體通過尿液排出K+、Na+等堿性離子來維持正常的酸堿平衡，導致血漿滲透壓降低并加強腎分泌碳酸氫鹽的能力，最終使血清中Cl-含量增加以及Ca2+含量下降。這與胡煜等[26]和黃德均等[27]研究發現熱應激期牛血清Ca2+含量降低、血清Cl-含量升高的結果一致。說明熱應激影響了摩拉和尼里-拉菲水牛的機體電解質平衡，K+和Ca2+分別呈顯著的上升與下降趨勢，而尼里-拉菲水牛可能具有更強的電解質代償能力來維持機體的內環境穩定。

4 結 論

在本試驗熱應激條件下，摩拉和尼里-拉菲水牛的內分泌激素水平和抗氧化能力下降，機體電解質平衡也受到影響，尼里-拉菲水牛的免疫功能也有一定下降；摩拉水牛表現出更強的清除自由基能力，尼里-拉菲水牛表現出更好的代謝、體溫調節能力以及電解質代償能力。