絞股藍多糖對D-半乳糖致衰老小鼠肝臟抗氧化能力的影響

張潤祥，白玉婷，張穎蕾，劉可可，王欣雨，董胤余，王曉麗

(廣西大學動物科學技術學院，南寧 530005)

衰老是細胞甚至機體功能逐漸衰退的結果，可由氧化應激等多種因素觸發[1]。研究證實，使用D-半乳糖(D-galactose,D-gal)誘導的小鼠會有自然衰老的癥狀，可加速活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產生并導致氧化應激[2-3]。超量的ROS會損傷DNA、蛋白質和磷脂的結構，最終導致細胞損傷，進而引起生理功能受損、發病率增加和壽命縮短，這種由ROS引起的氧化損傷和不可逆的累積是影響衰老過程的關鍵因素[4-5]。肝臟是機體最主要的解毒器官，是多個生理過程的關鍵樞紐，也是產生超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等多種抗氧化酶的場所，因此肝臟是特別容易受到氧化應激影響的器官之一[6-7]。

近年來，隨著中草藥多糖研究的開展，關于多糖抗衰老的探究也逐步深入。 絞股藍多糖(Gynostemmapentaphyllumpolysaccharides，GPP)是絞股藍的有效成分之一，具有免疫調節、降血脂及抗腫瘤等多種藥理活性[8-10]。目前，國內外鮮見有關GPP對D-gal致衰小鼠，尤其是對D-gal 致衰小鼠肝臟保護影響的報道。為此，本研究以D-gal建立衰老模型，采用多種方法探究不同劑量GPP對D-gal致衰老小鼠肝臟的抗氧化能力，以期為絞股藍及GPP的進一步研究與開發利用提供新的方向與理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物分組與樣品采集

60只4周齡SPF級昆明小鼠(許可證編號：SYXK桂2014-0001)，體重(20±1)g，購自廣西醫科大學動物實驗中心，實驗動物房標準鼠籠中飼養，每籠5只。小鼠隨機分為6組(雌雄各半)：空白對照組(Control)、模型組(D-gal)、陽性對照組(Vc)及絞股藍多糖低、中、高劑量組(GPP-L、GPP-M和GPP-H)，每組10只。空白對照組每天在頸背部皮下注射和腹腔注射生理鹽水；其余5組除每天頸背部皮下注射200 mg/kgD-gal外，腹腔注射依次為生理鹽水、Vc(200 mg/kg)、GPP(50、100和200 mg/kg)，42 d后稱重記錄，禁食，次日眼眶取血，處死后收集肝臟，部分組織置于Bouin氏固定液用于切片制作，其余組織液氮凍存，之后-80 ℃保存備用。

1.2 GPP提取與糖含量測定

絞股藍購自廣西中醫藥大學第一附屬醫院。經洗凈、烘干、粉碎后3 cm過篩加工，避光干燥保存。采用水提醇沉法提取GPP，苯酚硫酸法測定GPP含量為71.1%。

1.3 體重與臟器系數測定

試驗開始后，分別在1、7、14、21、28、35和42 d稱重并記錄。小鼠處死后，摘取肝臟生理鹽水清洗，濾紙吸干表面水分后稱重，計算臟器系數。

臟器系數(%)=臟器重量(mg)/體重(g)×100%

1.4 血清總抗氧化能力檢測

各組小鼠眼眶取血后，置于EP管4 ℃靜置2 h，待血液凝固后，冷凍離心機3 500 r/min離心15 min，取上清液分裝,于-80 ℃保存。 參照試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明書，采用酶標儀(Bio-Rad公司)檢測血清總抗氧化能力(T-AOC)水平。

1.5 肝組織各指標檢測

凍存肝臟組織解凍后，取部分樣品按1∶9(W/V)的比例預加冷生理鹽水，組織勻漿后離心取上清液，參照試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明書檢測SOD、GSH-Px、過氧化氫酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量；取部分樣品加入適量PBS，勻漿后3 000 r/min離心20 min，取上清液按照試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明書檢測ROS含量。

1.6 石蠟切片與HE染色

肝臟組織固定后，修整、沖洗，梯度酒精脫水，石蠟包埋，切片厚7 μm，于37～40 ℃水浴鍋內撈片，38 ℃烘箱內拷片。常規HE染色，中性樹脂封片，顯微鏡觀察并拍照。

1.7 統計學分析

數據采用SPSS 21.0軟件處理，圖片應用Image J軟件分析；組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 GPP對D-gal致衰老小鼠體重的影響

用藥開始后，每周稱量小鼠體重并記錄，經計算得出小鼠體重和增重的變化情況，結果見表1、2。由表1可知，隨日齡增長各組小鼠體重均呈現增長趨勢，7、21、28和35 d時GPP-M組小鼠體重顯著低于D-gal和GPP-H組(P<0.05)；42 d時GPP-M組小鼠體重顯著低于GPP-H組(P<0.05)，但與其他試驗組間差異均不顯著(P>0.05)。

表1 各組小鼠體重(n=10)

由表2可知，空白對照、D-gal、Vc、GPP-M和GPP-H組小鼠增重在29～35 d時達到最低，隨后出現增長的趨勢，而GPP-L組在22～28 d時先降低，經過29～35 d小幅度上升后再次出現下降趨勢；1～7 d時，GPP-M組小鼠增重顯著低于D-gal組(P<0.05)；15～21 d時，GPP-M組小鼠增重低于D-gal組，顯著低于GPP-H組(P<0.05)；29～35 d時，GPP-M組增重顯著低于GPP-L組(P<0.05)。 綜合來看，1～42 d GPP-M組小鼠增重最少。

表2 各組小鼠增重的變化(n=10)

2.2 GPP對D-gal致衰老小鼠肝臟指數及血清T-AOC的影響

由表3可知，GPP各劑量組肝臟指數均高于D-gal組，其中GPP-H組小鼠肝臟指數顯著高于D-gal 組(P<0.05)，與Vc和空白對照組相比均無顯著性差異(P>0.05)；不同劑量GPP組血清T-AOC活性與D-gal組相比均有所增強，且小鼠血清T-AOC活性隨GPP濃度的升高而增強，其中GPP-H組小鼠血清T-AOC活性最高，與D-gal組相比差異顯著(P<0.05)。

表3 衰老小鼠肝臟指數及血清中T-AOC水平

2.3 GPP對D-gal致衰老小鼠肝臟SOD、GSH-Px、CAT活性和ROS、MDA含量的影響

由表4可知，GPP各劑量組的小鼠肝臟組織SOD活性與D-gal組相比均無顯著差異(P>0.05)；不同劑量GPP處理后的小鼠肝臟中GSH-Px、CAT活性與D-gal組相比均有所增強，其中GPP-M組小鼠肝臟中GSH-Px活性顯著高于D-gal組(P<0.05)，GPP-L組小鼠肝臟中CAT活性顯著高于D-gal 組(P<0.05)，與Vc和空白對照組相比均無顯著差異(P>0.05)，3個劑量組間均無顯著差異(P>0.05)；不同劑量GPP處理后的小鼠肝臟組織中ROS、MDA含量與D-gal組相比均顯著下降(P<0.05)，其中GPP-L組小鼠肝臟組織中的ROS含量顯著低于GPP-M和GPP-H組(P<0.05)，且與Vc和空白對照組相比均有顯著差異(P<0.05)，GPP-L和GPP-H組肝臟中MDA含量與GPP-M組相比下降明顯，但3個GPP劑量組間差異均不顯著(P>0.05)。

表4 衰老小鼠肝臟中SOD、GSH-Px、CAT活性及ROS、MDA含量

2.4 GPP對D-gal致衰老小鼠肝臟組織形態結構的影響

各組小鼠肝臟經HE染色后，觀察肝臟組織形態，結果顯示，空白對照組小鼠肝細胞結構正常(圖1A)，中央靜脈無任何異常，肝索有規律的整齊排列，肝血竇無擴張；D-gal組小鼠肝細胞變大(圖1B)，胞漿嗜酸性增強，胞核增大，染色增強，且出現明顯的雙核肝細胞，肝細胞之間連接松散，部分肝細胞胞漿內可見小的脂肪顆粒，肝血竇擴張明顯；而經過Vc處理的小鼠肝細胞索排列整齊緊密(圖1C)，少量肝細胞可見雙核，與D-gal組相比出現脂肪顆粒的肝細胞減少；GPP-L組肝血竇擴張明顯(圖1D)，雙核肝細胞較多，肝細胞連接松散；GPP-M組肝血竇縮小(圖1E)，肝細胞索排列較整齊緊密，部分肝細胞可見雙核；GPP-H組與D-gal組相比肝血竇縮小(圖1F)，肝細胞連接緊密，存在脂肪顆粒的肝細胞明顯減少。

①A，空白對照組；B，D-gal組；C，Vc組；D，GPP-L組；E，GPP-M組；F，GPP-H組。②HC，肝細胞；BH，雙核肝細胞；HS，肝血竇；FP，脂肪顆粒；CV，中央靜脈

隨機選取每組小鼠肝臟切片3張，每張隨機選擇3個視野，運用Image J軟件進行分析，結果見表5。由表5可知，經GPP-H處理的小鼠肝臟肝索面積占比與D-gal組相比有所增加，與空白對照和Vc組相比占比相當，差異不顯著(P>0.05)；GPP-M和GPP-H組小鼠肝臟肝索面積占比顯著高于GPP-L組(P<0.05)。

表5 小鼠肝臟組織切片中肝索面積占比

3 討 論

3.1 D-gal衰老模型的建立

動物衰老模型是研究衰老及其機理以及抗衰老相關藥物等的前提和基礎。現代醫學研究中，有D-gal衰老模型、β-淀粉樣蛋白衰老模型、氯化鋁衰老模型、臭氧損傷衰老模型、γ-射線輻射衰老模型、胸腺摘除致衰老模型及各種轉基因衰老模型[11]。其中D-gal誘導的衰老以其操作簡單、成本低廉、周期短等優點被廣泛應用于制備衰老模型。D-gal是一種天然存在于人體內的正常營養素，當細胞內D-gal濃度過高，無法被半乳糖氧化酶催化生成醛糖和過氧化氫時會產生超氧陰離子，氧化產生大量自由基，超出機體清除能力，從而導致脂質過氧化；同時，最終分解產物可直接或間接與蛋白質、核酸、磷脂等物質結合，破壞細胞結構和功能，進而導致重要器官代謝紊亂，最終導致機體衰老[12-14]。張鑫等[15]用D-gal誘導小鼠原代皮膚成纖維細胞成功建立了衰老模型；張常娥等[16]用D-gal皮下注射8周，復制出與24月齡老年大鼠自然衰老程度相似的亞急性衰老模型。因此，本研究選擇D-gal致衰老模型來研究GPP對致衰老小鼠肝臟的保護作用。

3.2 GPP對D-gal致衰老小鼠體重、肝臟指數和組織形態結構的影響

小鼠的體重增長是反映各組小鼠生長發育情況的一個重要指標，而臟器指數的變化又可以體現出細胞衰老程度。葛水蓮等[17]、陳興浩等[18]研究發現，衰老模型組小鼠臟器指數顯著下降。本研究發現，D-gal組小鼠肝臟指數低于其他各組，且顯著低于GPP-H組，表明GPP改善了肝臟的衰老程度；各組小鼠體重均呈增長趨勢，D-gal組小鼠1～14 d增重高于其他各組，推測可能是由于致衰早期代謝物質在體內累積造成的，15～42 d增重低于GPP組，可能是由于GPP保護了致衰導致的臟器功能，促進了機體代謝和物質吸收。

肝細胞是肝臟的實質細胞，不僅可以調節碳水化合物、脂肪酸的代謝以及合成白蛋白、脂蛋白和膽固醇等物質，還可以促進藥物和外源性物質代謝等[19]。此外，肝細胞還可以釋放血管內皮生長因子，以此來控制肝臟的生長和修復[20]。隨著年齡的增長，肝細胞基因組逐漸出現不穩定，肝細胞數量減少，多核肝細胞數量增加，脂質過氧化產物積累和核DNA損傷[21]，衰老相關的信號通路如p16、p21和p53失調[22]。本研究從形態學角度發現，GPP可以改善由D-gal致衰導致的肝血竇變寬、雙核細胞增多、肝索面積減少、肝細胞內脂肪顆粒增多等，表明GPP可以恢復致衰小鼠的肝臟組織結構，保證其功能的完整性。

3.3 GPP對D-gal致衰老小鼠血清T-AOC的影響

正常情況下，氧自由基和抗氧化防御系統在機體內是動態平衡的。當異常情況發生時，由于機體防御自由基的系統失衡，致使各種酶活性降低、免疫功能下降等，從而導致機體的衰老和死亡。T-AOC可以反映出機體內抗氧化防御系統對自由基的總體抵抗能力。陳玉興等[23]、陳英等[24]研究發現，益智湯、石榴汁、小麥胚活性肽均可以提高衰老小鼠血清中T-AOC活性；趙蓮芳等[25]指出，黃芪多糖可以提高衰老小鼠血清和肝臟中T-AOC活性。本研究發現，GPP各劑量組也能使衰老小鼠血清T-AOC水平上升，表明GPP可以提高衰老小鼠對自由基過氧化的總體抵抗能力。

3.4 GPP對D-gal致衰老小鼠肝臟SOD、GSH-Px、CAT、ROS和MDA的影響

SOD可以清除機體內產生的氧自由基，從而能夠使細胞生物膜免受損傷，起到抗氧化作用。陳興浩等[18]研究發現，D-gal致衰老小鼠體內SOD活性大大降低，而牛乳清粉可以提高D-gal致衰小鼠SOD活性；汪群紅等[26]研究發現，西紅花可以很好地提升衰老大鼠SOD活性。本研究發現，GPP-M組能夠提升衰老小鼠肝組織中SOD活性，提示GPP能夠保護機體細胞膜，從而提高了衰老小鼠的抗氧化能力。

GSH-Px能夠將過氧化物和還原性谷胱甘肽催化還原，保護細胞生物膜結構和功能上的完整，從而達到增強機體抗氧化能力的目的。武錚等[27]研究發現，D-gal致衰老小鼠腦內的GSH-Px活性大大下降，而當歸多糖可以明顯提高腦內GSH-Px活性；馮沼潤[28]研究發現，天葵子可以改善D-gal致衰老小鼠血清和肝臟的GSH-Px活性。本研究發現，GPP可以很好地提高衰老小鼠肝臟的GSH-Px活性，表明GPP能夠保護和維持機體生物膜結構和功能的完整性，從而提高了衰老小鼠肝臟的抗氧化能力。

CAT的主要功能就是清除H2O2，抑制活性極強的羥自由基的生成，從而達到保護機體不受到羥自由基氧化損傷的作用。Lu等[3]研究發現，衰老小鼠CAT活性明顯降低，而烏索酸可以提高D-gal致衰老小鼠的CAT活性，起到神經保護作用；顏燕等[29]研究指出，絞股藍、山楂提取物可以提高D-gal致衰老小鼠肝臟的CAT活性。本研究發現，GPP也可以提高衰老小鼠肝臟的CAT活性，說明GPP可以增強衰老小鼠肝臟清除H2O2的能力，從而提高了衰老小鼠肝臟的抗氧化能力。

ROS是伴隨體內氧化過程產生的，如果超出了機體的清除能力，將會導致脂質過氧化；同時，這些最終分解產物可直接或間接與蛋白質、核酸、磷脂和其他物質結合，破壞細胞內生命物質的化學結構及細胞功能，從而導致重要器官代謝的紊亂，使得機體衰老[30]。唐漢慶等[31]研究發現，鐵皮石斛可以很好地降低小鼠體內ROS含量，提高其抗氧化能力；張秀麗[32]研究發現，梓醇可以降低腦中ROS含量，很好地保護衰老小鼠的神經細胞。本研究發現，GPP各劑量組均可以降低致衰老小鼠肝臟中ROS含量，表明GPP可以通過降低ROS含量提高其抗氧化能力，延緩衰老。

MDA是體內脂質過氧化產物，而機體內脂質過氧化水平便是由MDA含量的多少決定的[18]。MDA與蛋白質、核酸等交聯物具有異常的氫鍵，經溶酶體吞噬后不會被溶解消化，反而儲存在細胞內成為脂褐素，而脂褐素的大量堆積會導致細胞代謝紊亂，從而造成細胞的死亡。同時MDA作為細胞膜上不飽和脂肪酸過氧化反應的終末產物，可以反映機體內的氧化程度。葛水蓮[17]指出，經太行菊黃酮處理的D-gal致衰老小鼠肝臟、腦等組織中MDA含量均有所下降；汪群紅等[26]發現，西紅花可以明顯降低腦、肝臟、腎臟勻漿中MDA含量，延緩衰老。本研究發現，GPP各劑量組均可以降低衰老小鼠肝臟中MDA含量，表明GPP可以減少體內脂質的過氧化反應。

4 結 論

GPP可以有效提高D-gal致衰老小鼠肝臟抗氧化能力，延緩衰老，其中100 mg/kg GPP對D-gal致衰小鼠肝臟抗氧化效果最明顯。