鴨源綠色氣球菌的分離鑒定及16S rRNA基因序列測定與遺傳進化分析

喬宏興，丁 勇，張立恒，宋予震，董 青，邊傳周，趙俊強

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟學院動物醫(yī)藥學院，鄭州 450046；2.河南省動物腸道疫病國際聯(lián)合實驗室，鄭州 450046；3.河南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，鄭州 450002；4.河南融瑞祥制藥有限公司，商丘 476200)

綠色氣球菌(Aerococcusviridans)屬于鏈球菌科(Streptococcaceeae)氣球菌屬(Aerococcus)，是氣球菌屬的典型代表，最早于1953年由Williams等發(fā)現(xiàn)并命名[1]，目前已確定的氣球菌屬包括綠色氣球菌、脲氣球菌、人脲氣球菌、血氣球菌、柯氏氣球菌、馬脲氣球菌和陰道氣球菌7個不同種[2]。綠色氣球菌是革蘭氏陽性、微需氧和非運動性的細菌，該菌是一種人畜共患條件性致病菌，廣泛存在于自然界中，如空氣、塵埃、動物和人體中[3-5]，在人醫(yī)領(lǐng)域被廣泛研究，該菌正常情況下潛伏于機體內(nèi)，當機體免疫免疫力下降或免疫功能不健全時，可引發(fā)菌血癥、敗血癥、腦膜炎、心內(nèi)膜炎及膿毒性關(guān)節(jié)炎等疾病[6-8]，但也有報道稱機體在正常情況下感染綠色氣球菌并發(fā)病，引起社會廣泛關(guān)注。在動物醫(yī)學領(lǐng)域，有關(guān)綠色氣球菌的報道較少，目前已在豬[9]、羊[10]、牛[11]、鼠[13]、羅非魚[14]及蝦蟹[15-17]等動物體內(nèi)分離得到綠色氣球菌，但國內(nèi)外鮮有鴨源綠色氣球菌的報道。

2020年7月，河南省某鴨場出現(xiàn)鴨死亡，病鴨精神不振，食欲廢絕，眼鼻流出漿液性分泌物，糞便稀薄呈綠色或黃綠色。病鴨常有共濟失調(diào)、抽搐等神經(jīng)癥狀。剖解發(fā)現(xiàn)病變主要為肝周炎，疑為鴨傳染性漿膜炎，按照鴨傳染性漿膜炎治療未見明顯效果。本研究采集病料，利用鮮血瓊脂分離病原菌，經(jīng)形態(tài)學觀察、生化反應、藥敏試驗和16S rRNA基因鑒定，以期為鴨源綠色氣球菌病后期研究提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料

2020年7月于河南某鴨場采集4周齡患病鴨肝臟和脾臟。

1.2 主要試劑

TSB培養(yǎng)基、鮮血瓊脂培養(yǎng)基和生化鑒定管均購自青島海博生物有限公司；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司；藥敏紙片購自北京天明藥物有限公司；胎牛血清購自蘭杰柯科技有限公司。

1.3 試驗動物

25只18～22 g清潔級雄性昆明小鼠購自河南牧業(yè)經(jīng)濟學院實驗動物中心。

1.4 細菌分離純化

無菌采集病死鴨的肝臟和脾臟，劃線涂布于營養(yǎng)瓊脂平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后觀察菌落性狀，分別取單個菌落進行革蘭氏染色鏡檢，用接種環(huán)劃線接種于血平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)。

1.5 生化鑒定

將分離純化的菌落接種于TSB培養(yǎng)基，在37 ℃恒溫振蕩器內(nèi)振蕩培養(yǎng)24 h；取菌液接種于生化鑒定管，37 ℃培養(yǎng)24～96 h，對比結(jié)果判定表觀察并記錄結(jié)果。

1.6 16S rRNA鑒定

取純化后菌種送上海派森諾生物公司測序，采用通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGG-CTCAG-3′；1492R：5′-CTACGGCTACCTTGTTA-CGA-3′，預期擴增片段大小為1 324 bp。引物由上海派森諾生物科技股份有限公司合成。PCR反應體系50 μL：基因組DNA(20 ng/μL)1 μL，10×Buffer(含2.5 mmol/L Mg2+)5 μL，Taq聚合酶(5 U/μL) 1 μL，dNTPs (10 mmol/L) 1 μL，上、下游引物各1.5 μL，ddH2O 39 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。反應完成后，取3 μL PCR產(chǎn)物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。用NCBI BLAST程序?qū)⑵唇雍蟮男蛄信cNCBI 數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進行比對，得到與待測物種序列相似性最大的物種信息，即為鑒定結(jié)果。將測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中的菌株進行比對分析，利用Mega 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。參考菌株信息見表1。

表1 參考菌株信息

1.7 致病性試驗

取培養(yǎng)好的分離菌菌落，接種于TSB液體培養(yǎng)基(含5%胎牛血清)中，37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，利用平板計數(shù)法將菌液濃度調(diào)整為5×109CFU/mL，10倍倍比稀釋為5×109、5×108、5×107和5×106CFU/mL 4個濃度。試驗分5組，每組5只小鼠。對照組腹腔注射0.5 mL無菌TSB液體培養(yǎng)基；試驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組分別腹腔注射0.5 mL 5×106、5×107、5×108和5×109CFU/mL分離菌。注射后連續(xù)觀察7 d，每隔6 h觀察并記錄小鼠發(fā)病表現(xiàn)、死亡數(shù)量。對死亡小鼠病變臟器進行細菌分離鑒定，根據(jù)試驗各組小鼠死亡數(shù)量，采用改良寇氏法計算分離菌株的半數(shù)致死量(LD50)。

1.8 藥敏試驗

取純化菌種于TSB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，調(diào)整菌液濃度為0.5麥氏濁度，取0.5 mL菌液于血平板，用玻棒涂布均勻，取藥敏紙片貼在血平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，使用游標卡尺測量抑菌圈直徑(inhibition zone diameter,IZD)，并按照藥敏紙片說明書的抑菌范圍注釋標準對細菌的藥物敏感性進行判斷。

2 結(jié) 果

2.1 細菌分離培養(yǎng)

分離菌在鮮血平板上呈乳白色菌落，表面光滑凸起，邊緣整齊圓潤，較小(圖1)。顯微鏡下觀察為革蘭氏陽性菌，呈二聯(lián)或四聯(lián)排列(圖2)。將分離菌命名為Y4。

圖1 分離菌形態(tài)觀察

圖2 分離菌革蘭氏染色鏡檢圖(1 000×)

2.2 生化特性

將疑似菌落進行生化特性鑒定，結(jié)果見表2。由表2可知，分離菌能發(fā)酵麥芽糖、蔗糖和棉籽糖，不能發(fā)酵木糖、乳糖、葡萄糖、山梨醇和甘露醇；硝酸鹽還原試驗、MP-VP試驗呈陽性，甲基紅試驗呈陰性；與尿素、七葉苷發(fā)生反應，不能與硫化氫、苯丙氨酸發(fā)生反應；不能利用枸櫞酸鹽；與賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶接觸試驗均為陽性，與氨基酸脫羧酶接觸試驗不發(fā)生反應。

表2 分離菌生化鑒定結(jié)果

2.3 16S rRNA鑒定結(jié)果

將分離菌純化后送上海派森諾生物公司測序，結(jié)果表明，該菌核苷酸序列全長為1 324 bp,16S rRNA基因PCR擴增結(jié)果與測序結(jié)果一致(圖3)。由圖4可知，分離菌與12株分離自豬、犬、奶牛、羅非魚、龍蝦、海水和空氣等的綠色氣球菌核苷酸相似性在94.8%以上；與菌株NFL01、Mnlv1、Mnlv2、W66和FL09相似性最高，達99.9%；與菌株1D024和219的核苷酸相似性分別為99.6%和99.5%；與菌株GXBL-1核苷酸相似性最低，為94.8%。

M，DL2000 DNA Marker；1，分離菌；2，陰性對照

圖4 分離菌株16S rRNA基因核苷酸序列相似性分析

由圖5可知，分離菌與菌株FL09親緣關(guān)系最近，為一獨立的小分支；與菌株15MS、DSD-PW4-OH13和Mnlv2親緣關(guān)系較近，在同一大分支上；與菌株GXBL-1親緣關(guān)系較遠。說明不同物種間親緣關(guān)系存在差異性。綜合分離菌形態(tài)學特征、生化特性鑒定及16S rRNA基因測序分析，判斷分離菌為綠色氣球菌。

圖5 基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 致病性試驗結(jié)果

接種分離菌菌液后6 h，試驗Ⅰ、Ⅱ組小鼠精神沉郁，食欲減退，畏寒怕冷；試驗Ⅲ、Ⅳ組小鼠精神萎靡，食欲廢絕，畏寒怕冷。12 h后，試驗Ⅰ、Ⅱ組小鼠精神開始恢復，食欲增加；試驗Ⅲ組小鼠死亡2只，試驗Ⅳ組小鼠全部死亡。24 h后試驗Ⅰ組恢復正常，試驗Ⅱ組死亡1只，其余小鼠恢復正常：試驗Ⅲ組死亡3只，其余精神開始恢復，食欲增加。48 h后各試驗組小鼠恢復正常。對照組小鼠無任何明顯的臨床癥狀，均健活。分離菌對小鼠致病性具體結(jié)果見表3。

表3 分離菌對小鼠致病性結(jié)果

對死亡及發(fā)病小鼠剖解發(fā)現(xiàn)，小鼠肝臟、脾臟腫大，有出血點，腸道脹氣呈透明狀，肺臟有出血點，采集其肝臟、脾臟，接種于鮮血平板培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，革蘭氏染色觀察得到形態(tài)單一的陽性球菌。對照組小鼠剖解臟器無明顯變化。試驗結(jié)果表明，綠色氣球菌隨著接種濃度增大，致病性增強，當菌液濃度達到5×107CFU/mL時具有致死性,通過計算得到該分離菌的LD50為4.8×108CFU/mL。

2.5 藥敏試驗結(jié)果

由表4可知，分離菌對磷霉素、氨芐西林和阿莫西林敏感，對青霉素、新生霉素、阿米卡星、頭孢唑林、頭孢噻肟、頭孢他啶中度敏感；對利福平、新霉素、桿菌肽、紅霉素、恩諾沙星、林可霉素、慶大霉素、大觀霉素、卡那霉素、鏈霉素耐藥。

表4 藥敏試驗結(jié)果

3 討 論

綠色氣球菌是一種人畜共患條件性致病菌，已知其可感染人和多種動物，廣泛存在于周圍環(huán)境中。本試驗從臨床發(fā)病鴨病料中分離到1株疑似綠色氣球菌，并進行分離培養(yǎng)、生化試驗和16S rRNA鑒定。目前，16S rRNA鑒定方法是鑒定動物病原菌的主要方法之一[12]。16S rRNA序列比對結(jié)果表明，本試驗分離菌與NCBI數(shù)據(jù)庫中11株綠色氣球菌的相似性均高達99%以上，結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)分離株與分離自豬、羅非魚、龍蝦、犬、植物、奶牛、環(huán)境中的綠色氣球菌聚在一簇，鑒定該菌為綠色氣球菌。根據(jù)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹及核苷酸序列相似性分析結(jié)果可知，寄生在不同物種體內(nèi)的綠色氣球菌在進化過程中遺傳變異程度較大，但受地域環(huán)境、時間等外界影響不明顯。目前已從多種動物體內(nèi)分離到綠色氣球菌，表明該菌在自然界環(huán)境中廣泛存在，提示人們應當注意該菌作為一種條件性致病菌對人和動物的危害。國內(nèi)外對人和其他動物感染綠色氣球菌的病例報道較多，但有關(guān)鴨源綠色氣球菌的研究較少，對于該菌是否對當前養(yǎng)鴨業(yè)存在一定的風險，鴨場感染綠色氣球菌的比例有多高，是否存在與其他細菌如鴨疫李默氏桿菌的混合感染等研究較少，因此，未來需對鴨源不同分離株及不同物種之間的分離株進一步研究。

分離菌致病性研究結(jié)果表明，該菌具有致病性，且隨接種劑量增大，致病性隨之增強。閻朝華等[13]首次在竹鼠上分離得到綠色氣球菌，結(jié)果顯示綠色氣球菌具有較強致病性；可小麗等[14]首次在羅非魚上分離得到2株綠色氣球菌，結(jié)果表明高濃度、大劑量菌液對試驗動物具有較強致病性，且隨著環(huán)境脅迫作用而加強。在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面，綠色氣球菌引起的最常見的疾病是暴發(fā)性龍蝦高夫敗血癥[15-17]及其他各種蝦蟹類疾病[18]，致病性極強。張樂宜等[9]在廣東部分豬場分離得到6豬綠色氣球菌，通過動物試驗表明，不同分離菌有不同程度的致病性；付琦媛等[19]對小進行鼠致病性試驗及回歸性試驗，結(jié)果表明綠色氣球菌具有較強致病性，有致死性。本研究與前期報道基本一致，表明該菌對多種動物具有一定的致病性，其致病機理有待于進一步研究。

從20世紀80年代起，隨著抗生素的廣泛使用，綠色氣球菌開始對抗生素出現(xiàn)耐藥性。可小麗等[14]研究表明，分離株對β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類藥物敏感；對部分大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類抗生素類藥物耐藥。張乃嘉等[20]發(fā)現(xiàn)，分離株主要對頭孢類和喹諾酮類抗生素敏感，對部分氨基糖苷類、四環(huán)素類抗生素耐藥。董文龍等[21]對6株綠色氣球菌進行耐藥性分析，結(jié)果表明分離菌具有多重耐藥表型，只對阿米卡星、氟苯尼考、環(huán)丙沙星及恩諾沙星較敏感；Chen等[22]發(fā)現(xiàn)氣球菌對環(huán)丙沙星、克林霉素、慶大霉素、磺胺甲噁唑、甲氧芐氨嘧啶和四環(huán)素耐藥。本試驗中綠色氣球菌分離菌株對磷霉素敏感，對部分大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類藥物和喹諾酮類藥物耐藥，這與其他地區(qū)不同分離源的綠色氣球菌株藥敏結(jié)果不完全一致，顯示出時間與地域上的差異[23]。不同環(huán)境中的選擇性壓力及抗生素的長期使用已引起綠色氣球菌耐藥性的產(chǎn)生，同時也突出了藥敏檢測的重要性。目前，綠色氣球菌的詳細耐藥機制及相關(guān)抗性基因尚且不得而知，但就目前現(xiàn)狀來看，對其進行耐藥性研究十分必要。

4 結(jié) 論

本研究分離得到1株綠色氣球菌，致病性試驗結(jié)果表明該菌具有致死性，遺傳進化結(jié)果表明不同地域、不同物種分離菌具有差異性。