人脫細胞羊膜在生物醫學領域中的應用研究進展

許發亞, 何 琪, 李細艷, 涂 皎, 肖雁冰

(遵義醫科大學附屬婦幼保健院 婦產科, 貴州 遵義, 563000)

組織工程概念核心是建立細胞與支架材料的復合體，并用于病損部位的組織修復、結構重建和功能恢復[1]。組織工程的順利實施及應用需要具有以下3個方面的條件: ① 合適的種子細胞; ② 支持細胞黏附和生長的支架材料; ③ 誘導、調控組織增殖分化的生物活性因子[2]。支架材料作為種子細胞的人工細胞外基質，擔負了種子細胞生長、繁殖及形成新組織的重要責任，而理想的支架材料應具有以下優點: ① 低免疫原性，在體內無排斥反應; ② 良好的生物相容性，在體內無炎癥反應和毒性反應; ③ 分泌細胞生長因子，為種子細胞生長繁殖提供保障; ④ 有三維立體空間結構，表面的微結構有利于細胞的黏附和生長; ⑤ 可塑性，能夠適用于不同的周圍環境，保持特定的彈性[3]。人脫細胞羊膜支架是經過特定處理后得到的一種具有良好空間結構的天然支架材料[4], 因其具有良好的生物相容性、低免疫原性、三維立體空間結構及取材容易等優良特性而被廣大學者所關注，成為組織工程的研究熱點。本研究結合相關文獻對人脫細胞羊膜支架在生物醫學領域應用的研究進展進行綜述。

1 人脫細胞羊膜特性

人羊膜是位于胎盤最外層接觸羊水的一層膜性組織，無神經及血管，具有豐富的細胞外基質，其大致分為具有人羊膜上皮細胞的上皮層、有大量膠原蛋白的基底膜層、致密層、纖維母細胞層以及海綿層。在應用物理、化學或生物酶制劑進行脫細胞處理時，可去除羊膜的上皮細胞組分，為后續種植上的種子細胞提供更大的三維立體空間結構。人脫細胞羊膜作為一種天然的支架材料，擁有第Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ型膠原[5], 同時也具有纖維粘連蛋白、層粘連蛋白、整合素、彈性蛋白等多種蛋白，上述成分決定了人脫細胞羊膜具有一定的彈性及機械強度[6]。人脫細胞羊膜還具有堿性成纖維細胞因子、透明質酸、轉化生長因子等多種有效成分[7], 也可以促進器官或者組織的修復。人新鮮羊膜本身就具有低免疫原性，在對其進行脫細胞處理的同時也會將其致免疫性的細胞成分一并脫下，更進一步降低其免疫原性[8]。將人脫細胞羊膜與牙周膜干細胞(PDLSCs)[9]、脂肪間充質干細胞(AMSCs)[10-11]、骨髓間充質干細胞(BMSCs)[12-13]、人羊膜間充質干細胞(hAMSCs)[14]等多種間充質干細胞聯合培養后，均顯示人脫細胞羊膜對多種間充質干細胞有良好的生物相容性，并可分泌多種促進細胞和(或)組織增殖修復的生物活性因子。楊德宇等[11]對人脫細胞羊膜進行的力學拉伸實驗證明了其具有良好的彈性、抗拉伸及抗變形的能力，能夠滿足大部分組織和(或)器官對生物支架的可塑性要求。基于上述人脫細胞羊膜的良好特點，其可作為組織工程中一種新型的生物支架材料。

2 人脫細胞羊膜支架在生物醫學領域的應用

近年來，基于人脫細胞羊膜的優良特性，其用于軟組織修復、骨損傷重建、皮膚再生、預防粘連等的研究越來越多。人脫細胞羊膜本身具有的促進組織和(或)器官修復的間充質干細胞及生長活性因子含量相對較少，故目前常用作生物支架負載聯合其他間充質干細胞協同對組織和(或)進行修復，并表現出廣闊的應用前景。

2.1 軟組織修復

2.1.1 關節軟骨組織工程: 關節軟骨主要分布于長骨末端，是一種無神經、無血管的致密結締組織，主要發揮在運動過程中的減震作用，損傷后治療不及時將會罹患上骨關節炎、長期慢性疼痛以及導致殘疾的概率升高[15]。關節軟骨具有缺乏氧氣、缺少血液供應的特殊生理結構，這就導致其營養物質的來源十分有限，自我修復的能力較差[16]。目前，臨床上重度軟骨損傷的治療方式仍以物理治療聯合手術為主，但治療效果因人而異，且對家庭經濟情況要求較高。優良的細胞支架為種子細胞提供適宜的存活環境，可增強其增殖分化能力并提高細胞利用率。賈海棟等[17]設計實驗將人脫細胞羊膜負載BMSCs后植入家兔軟骨損傷患處，證實二者除了具有較好的生物相容性外，且促進軟骨組織修復的效果優于單獨使用支架或細胞治療，考慮人脫細胞羊膜對關節腔內的干細胞有一定的募集作用，并且可以促進BMSCs在此處的增殖與分化，因此可以促進軟骨組織的修復。ZHANG J等[18]也將人脫細胞羊膜聯合hAMSCs植入兔軟骨損傷處，結果也證實了聯合使用細胞及支架組較單獨使用細胞組的治療效果更顯著。因此，人脫細胞羊膜能夠增加細胞的黏附和增殖分化，在周圍環境不理想的情況下為干細胞的治療效果提供環境支持，為組織工程在相對特殊生理結構的組織治療中提供了新的思路。

2.1.2 心臟組織工程: 心肌梗死是目前發病率及病死率較高的一種疾病[19]。目前心肌梗死的治療局限性在于只能改善發病后的情況，并不能恢復梗死的心肌細胞的功能，而唯一的治療方式則是心臟移植，這就意味著需要面臨供體不足和移植后強大的排斥反應的情況，顯然這并不是一種很理想的治療方式。為了解決這一困難, BLUME G G等[20]將人脫細胞羊膜用可吸收縫合線置于心肌梗死大鼠左心室壁，并在30 d后對大鼠進行觀察，結果顯示實驗大鼠左心室射血分數有顯著恢復，心肌細胞及血管組織在病損處再生。人脫細胞羊膜支架能夠恢復心肌細胞生理功能，可以為運輸其他治療因子提供機械支持，為心血管疾病治療提供了新的治療手段。

2.1.3 氣管尿道重建: 氣管狹窄是氣管插管或氣管切開術后引起的嚴重并發癥[21], 后期形成的瘢痕及纖維化在行手術治療切除后會造成較大面積的氣管缺損，當缺損長度超過斷端吻合極限的時候，則需要考慮人工合成氣管來代替。理想的氣管替代物需要擁有良好的生物相容性以及適當的降解率，最好可以促進細胞黏附和增殖分化[22]。BAGGIO SIMEONI P R等[23]利用人脫細胞羊膜負載人臍帶間充質干細胞(hUMSCs)置于兔氣管缺損模型處, 2個月后觀察發現氣管缺損處修復效果較對照組顯著提高。尿道的先天畸形、手術創傷、外傷等可能會導致尿道狹窄，長度較大的尿道狹窄段切除后無法進行斷端吻合術，而傳統尿道修復材料如自體小腸黏膜下層、口腔黏膜、頰黏膜等，因供體組織材料不足且術后供體部位極易發生神經損傷、瘢痕、攣縮等并發癥，這種犧牲自我組織替代新組織的方法并不是臨床治療所鼓勵的。ZHANG D L等[24]利用人脫細胞羊膜負載皮膚上皮細胞用于兔尿道缺損修補，術后發現新尿道上皮黏膜光滑平整，新生血管豐富，而且新尿道尿流速率與正常尿道相同，功能性較正常尿道無明顯差異，據此認為采用人脫細胞羊膜替代組織材料修復尿道缺損這一方法是可行的。張鑫等[25]對犬尿道造成3 cm的缺損，而后利用人脫細胞羊膜負載BMSCs和血管內皮祖細胞后縫合于尿道缺損處，術后新生尿道的管壁光滑、無狹窄，未見明顯瘢痕形成，排尿也正常，證明采用脫細胞羊膜支架對尿道缺損有良好的修復效果，或可作為一種新的尿道替代材料用于修復尿道缺損。

2.2 骨缺損組織工程

在骨損傷中，原始骨組織的愈合及新生骨的形成和成熟是一個相當漫長的過程，目前的骨缺損修補技術已有很多，包括自體骨移植、異體骨移植、異種骨移植、骨延長術和骨膜誘導術等[26], 但這些方法的主要缺點是供體骨來源有限、患者疼痛加重、生物材料療效不確定、愈合周期過長、治療費用高等。骨膜具有多種間充質干細胞及成骨細胞，手術后去除部分骨膜會嚴重影響骨組織的正常恢復，而目前構建組織工程骨膜也是治療骨缺損的一種重要的治療方式。肖正俊等[27]采用人脫細胞羊膜與BMSCs構建組織工程骨膜，在進行誘導分化后在電鏡下觀察有大量成骨組織生成，可置于骨缺損處誘導成骨組織的生長。TANG K等[7]研究表明人脫細胞羊膜增加了骨形成和骨重塑，并且可以影響BMSCs、破骨細胞、成骨細胞等的募集和活化，從而促進骨再生，考慮與細胞募集和骨重塑有關的趨化性細胞受體因子-4(CXCR-4)、單核細胞趨化蛋白(MCP-1)、OC和組織蛋白酶K(CatK)的基因表達在植入的缺損處增強而治療骨缺損有關。人脫細胞羊膜具有與骨膜相同的特點，可以提供給缺損骨組織營養物質，生成機械屏障，同時能刺激細胞的募集和活化，刺激成骨細胞的生成，從而促進骨組織的修復。

2.3 皮膚再生

皮膚被認為是人體最重要的器官之一，具有重要的功能，不僅可以抵御各種外界的有害物質的侵入，維持內環境的穩定，而且可以調節機體溫度[28]。竺亞斌等[29]將人脫細胞羊膜覆蓋在背部皮膚全層損傷大鼠模型上，外側用無菌紗布包裹, 3周后使用人脫細胞羊膜的大鼠皮膚已基本愈合，且愈合程度顯著優于普通治療組，考慮人脫細胞羊膜對皮膚損傷具有較好的治療效果。重度燒傷患者主要的治療方式是植皮[30]，其中包括自體皮膚移植和異體皮膚移植，但無論是哪種方法，患者都是要承受巨大的經濟壓力和痛苦。KITALA D等[31]采用人脫細胞羊膜治療1例重度燒傷患者, 12 d后該患者痊愈出院，相較于同期進行異體皮膚移植患者的住院周期顯著縮短，患者術后亦無排斥現象，也沒有疼痛、過敏以及傷口感染的情況。對于皮膚創口而言，人脫細胞羊膜支架不僅屬于種子細胞的細胞外基質，同樣也可作為傷口的敷料用于減少感染和治療。

糖尿病患者因自身疾病的原因，產生的傷口很長時間不能恢復，后期極易發生感染、壞死等可能，糖尿病傷口已嚴重影響到患者的日常生活及心理狀況[32]。除了首要控制血糖以外，傷口的手術清創和外用移植物也是糖尿病傷口的治療方式之一。XIAO S E等[33]將已分離出的AMSCs外泌體種植于人脫細胞羊膜支架上，然后置于糖尿病動物模型的傷口處，結果表明AMSCs外泌體聯合人脫細胞羊膜支架可以調節傷口部位的炎性免疫因子、促進周圍血管增殖和促進細胞外基質的產生來加速傷口的愈合，人脫細胞羊膜支架聯合干細胞外泌體在此方面展現出了巨大的治療潛力。下肢靜脈性潰瘍是深靜脈瓣關閉不全導致靜脈回流障礙，靜脈壓升高導致下肢皮膚破損，易在同一區域反復發作，并會導致破潰感染、長期慢性疼痛、下肢皮膚色素沉著、硬化甚至惡變的可能。WU Z P等[34]在臨床上經過患者知情同意后將人脫細胞羊膜直接放在患者靜脈潰瘍處用無菌紗布包裹，結果表明僅2周時間潰瘍面積顯著縮小，患者疼痛感顯著好轉，潰瘍周圍炎性滲出物及新生肉芽腫也顯著減少，且治療完成后患者未出現炎癥及過敏反應，治療費用也遠低于普通治療方案。

在皮膚再生的治療中，人脫細胞羊膜具有豐富的膠原，可以促進皮膚上皮細胞的再生，也可以作為生物支架為種子細胞提供生長繁殖的細胞外基質，還可以作為抗菌消炎的機械屏障，在治療過程中使用方法簡便、易于移植，無任何不良反應，也不用擔心其降解率的問題。

2.4 預防粘連

肌腱粘連會導致肢體運動受限，嚴重影響患者后期的生活質量，臨床上多運用加強手術縫合方式、加用防粘連物質及其他人工合成材料等減輕術后肌腱粘連情況[35], 但效果都不盡如人意，且人工合成生物材料存在排斥反應大、低降解率等缺點。白江博等[36]考慮用低免疫原性的人脫細胞羊膜降低移植后的排斥反應，因良好的降解率也無需二次手術，在對肌腱損傷的動物模型中運用人新鮮羊膜及人脫細胞羊膜后表明二者均可預防肌腱粘連，結果證明因人新鮮羊膜有間充質干細胞，較人脫細胞羊膜有更好的預防肌腱粘連的效果。馮勇等[37]通過比較人脫細胞羊膜、藥物及生長因子對預防肌腱粘連的作用，認為人脫細胞羊膜除了在治療肌腱損傷方面可以起到屏障作用，在早期預防肌腱粘連方面也有不錯的療效，因其具有活性的細胞已被去除，后期加之使用具有分化能力的干細胞，將是預防肌腱粘連的新方向。

運用干細胞治療宮腔粘連是許多學者共同研究的目標，但干細胞不能在受損的宮腔部位長期存活，使之不能達到應有的治療效果[38]。常用的宮腔支架主要是宮內節育器、球囊支架以及透明質酸等[39], 但因其具有壓迫內膜、引起感染、在宮腔內存活時間短、對干細胞的生長無促進作用等問題，并非是理想的宮腔支架材料。HAN X等[40]將AMSCs聯合人脫細胞羊膜支架放入宮腔粘連大鼠模型宮腔內，術后觀察大鼠子宮血管生成因子上升, CD34免疫組化及免疫熒光表達均上升，考慮聯合移植物是通過促進血管生成增加子宮內膜血流量，從而修復失去功能的內膜基底層。CHEN X等[41]將人脫細胞羊膜支架放入大鼠宮腔粘連的模型中，結果顯示該支架通過抑制結締組織生長因子和下調基質金屬蛋白酶-2抑制劑的表達而發揮抑制子宮內膜纖維化的作用。人脫細胞羊膜良好的可塑性及機械彈性將成為未來治療宮腔疾病的新型常用支架材料。

3 總結與展望

人脫細胞羊膜支架具有獨特優點: ① 人脫細胞羊膜支架是一種天然支架，取材簡便且無倫理爭議，無細胞毒性，具有多種生物活性因子，更有利于種子細胞的黏附及生長繁殖，能在受損部位有較長的存在時間。② 人脫細胞羊膜可由使用者隨意選取所需要的大小，放入別的支架所不能置入的部位。③ 人新鮮羊膜具有低免疫原性，在經過脫細胞處理后免疫成分再次被脫去，使之免疫原性更低，在動物或人體上幾乎無排斥反應，這都是其他生物支架所不能比擬的。

就臨床安全性而言，特別是作為傷口敷料這一方面，人脫細胞羊膜已被國家批準用于治療臨床的燒傷及創面缺損治療(國械注準20153462192)，其安全性尚無明顯的爭議。此外，人脫細胞羊膜來源廣泛，制備及儲存條件相對簡便，治療費用也大大降低，在軟組織修復、骨組織再生、皮膚再生及預防組織粘連等方面具有廣闊的應用前景，是組織工程學的理想候選支架材料。