miR-139-5p靶基因參與調(diào)控人骨肉瘤細(xì)胞表型的機(jī)制分析*

魏代平，李海龍，顏春魯△，汪永鋒，呂棟輝，張金龍，李嘉進(jìn)

1.甘肅省蘭州市皋蘭縣人民醫(yī)院骨科，甘肅蘭州 730299；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅蘭州 730000

骨肉瘤是一種起源于間葉組織的侵襲性惡性骨腫瘤，其發(fā)病率和病死率在原發(fā)性骨腫瘤中均居首位。約60%的病例是10～20歲的兒童和青少年。近年來研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在骨肉瘤中異常表達(dá)，參與了骨肉瘤細(xì)胞多種惡性表型的生物學(xué)過程，有可能成為骨肉瘤診斷、治療監(jiān)測(cè)、預(yù)后判斷的重要標(biāo)志物[1]。

有研究報(bào)道，骨肉瘤組織中miR-139-5p的表達(dá)下調(diào)。miR-139-5p通過靶向調(diào)控SLITRK4[2]、NOTCH1[3]、GPR56[4]、Rock1[5]、RUNX2[6]、DNMT1[7]、CDK14[8]等基因，抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。目前，普遍的研究思路是探討miRNA在腫瘤組織中的功能和對(duì)表型的影響，需在生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證研究。然而，這種預(yù)測(cè)存在著一定程度的偶然性和盲目性。本文借助于生物信息學(xué)方法，對(duì)miR-139-5p的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，并對(duì)靶基因進(jìn)行信號(hào)通路富集分析，再選擇與腫瘤有關(guān)的信號(hào)通路中的基因進(jìn)行蛋白質(zhì)互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)分析，而后篩選PPI網(wǎng)絡(luò)中的參數(shù)，選擇Cytoscape3.8軟件構(gòu)建關(guān)鍵核心基因；對(duì)關(guān)鍵核心基因使用HCMDB數(shù)據(jù)庫，分析其在骨肉瘤中的表達(dá)，從而解析miR-139-5p的靶基因及其調(diào)控惡性表型的分子機(jī)制，為骨肉瘤分子標(biāo)志物研究提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 從dbDEMC(https://www.biosino.org/dbDEMC/)數(shù)據(jù)庫檢索到GEO(GSE28423)數(shù)據(jù)集,包含19個(gè)骨肉瘤細(xì)胞系及4個(gè)正常對(duì)照細(xì)胞的miRNA表達(dá)譜，從中檢索miR-139-5p的表達(dá)。從HCMDB數(shù)據(jù)庫(http://hcmdb.i-sanger.com/index)檢索到44例GEO(GSE14359和GSE32981)數(shù)據(jù)集中骨肉瘤組織和正常組織表達(dá)，用于驗(yàn)證miR-139-5p的關(guān)鍵核心基因的差異表達(dá)。

1.2方法

1.2.1miR-139-5p在骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá) 使用dbDEMC數(shù)據(jù)庫檢索miR-139-5p在骨肉瘤細(xì)胞中相對(duì)于正常對(duì)照細(xì)胞的差異表達(dá)。

1.2.2miR-139-5p靶基因預(yù)測(cè)和靶基因富集信號(hào)通路分析 使用miRSystem網(wǎng)站(http://mirsystem.cgm.ntu.edu.tw/index.php)中集成的DIANA、MIRANDA、MIRBRIDGE、PICTAR、PITA、RNA22、TARGETSCAN軟件對(duì)miR-139-5p的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析，選取至少3個(gè)軟件支持的靶基因作為下一步分析的候選基因，對(duì)所檢索到的靶基因使用DAVID6.8(https://david.ncifcrf.gov/)軟件進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集分析，富集聚類分析采用Fisher確切概率法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α<0.05。

1.2.3miR-139-5p靶基因的腫瘤相關(guān)信號(hào)通路PPI網(wǎng)絡(luò)分析 選擇在線軟件string(https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫，將72個(gè)miR-139-5p靶基因中與腫瘤信號(hào)通路具有相關(guān)性的基因輸入在線軟件string進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，觀察節(jié)點(diǎn)，分析其節(jié)點(diǎn)后，對(duì)節(jié)點(diǎn)和周邊數(shù)據(jù)進(jìn)行提取并導(dǎo)出文件。

1.2.4選擇miR-139-5p的腫瘤相關(guān)信號(hào)通路基因進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與關(guān)鍵基因分析 將PPI數(shù)據(jù)庫構(gòu)建作用靶點(diǎn)輸入Cytoscape3.8軟件構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，采用其插件MCODE計(jì)算參數(shù)，篩選關(guān)鍵基因。

1.2.5腫瘤密切相關(guān)通路基因的表達(dá)情況分析 選擇前述的關(guān)鍵基因，檢索HCMDB數(shù)據(jù)庫，利用在線軟件檢索分析這些關(guān)鍵基因在骨肉瘤組織中的表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1miR-139-5p在骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá) 使用dbDEMC數(shù)據(jù)庫檢索了miR-139-5p在骨肉瘤細(xì)胞中相對(duì)于正常對(duì)照細(xì)胞的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-139-5p在骨肉瘤細(xì)胞中明顯表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，見圖1。

圖1 miR-139-5p在骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)

2.2miR-139-5p靶基因預(yù)測(cè) 使用miRSystem網(wǎng)站的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了miR-139-5p的靶基因預(yù)測(cè)，以至少3個(gè)軟件支持的靶基因作為選擇標(biāo)準(zhǔn)，共獲得407個(gè)靶基因。

2.3miR-139-5p靶基因富集信號(hào)通路分析 將所獲得的407個(gè)靶基因輸入DAVID6.8在線軟件進(jìn)行信號(hào)通路分析，共獲得59條信號(hào)通路，其中，有21條信號(hào)通路與腫瘤有關(guān)，見表1。這些通路包括mTOR通路、癌癥中的蛋白多糖、小細(xì)胞肺癌、cAMP信號(hào)通路、細(xì)胞外受體相互作用、焦點(diǎn)粘連、膠質(zhì)瘤等。

表1 miR-139-5p靶基因富集信號(hào)的21條腫瘤相關(guān)信號(hào)通路

2.4miR-139-5p靶基因腫瘤通路PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果 有73個(gè)基因富集在與腫瘤密切相關(guān)的信號(hào)通路中(表1)，將其輸入在線軟件string進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，并將其聚類在3個(gè)模塊中(圖2)。分析其節(jié)點(diǎn)，Cytoscape3.8軟件的插件MCODE計(jì)算參數(shù)，篩選出IGF1R、NOTCH1、CDH1、FOS、FN1、JUN、CDC42、CXCR4、RPS6KB1共9個(gè)基因?yàn)殛P(guān)鍵基因。

圖2 Cytoscape軟件的MCODE插件篩選的9個(gè)關(guān)鍵核心基因

2.5miR-139-5p靶基因中關(guān)鍵核心基因在骨肉瘤中的表達(dá)分析 選擇在線HCMDB數(shù)據(jù)庫，檢索分析9個(gè)miR-139-5p的靶基因中的關(guān)鍵核心基因IGF1R、NOTCH1、CDH1、FOS、FN1、JUN、CDC42、CXCR4、RPS6KB1在骨肉瘤中的表達(dá)(圖3)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NOTCH1、FN1、CXCR4、RPS6KB1在正常組織與骨肉瘤組織之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這4個(gè)靶基因作為miR-139-5p的預(yù)測(cè)靶基因，至少獲得3個(gè)軟件支持(表2)。

圖3 關(guān)鍵核心基因在正常組織與骨肉瘤組織之間差異表達(dá)(HCMDB數(shù)據(jù)庫)

表2 miR-139-5p的靶基因預(yù)測(cè)軟件支持情況

3 討 論

人類miR-139-5p屬于miR-139家族，其成熟體核心堿基序列為“UCUACAGUGCACGUGUCUCCAGU”。有研究指出，miR-139-5p在腫瘤組織中高表達(dá)，其表達(dá)與肺癌[9]、子宮內(nèi)膜癌[10]、卵巢癌[11]、膀胱癌[12]、食管癌[11]、胃癌[13]等多種腫瘤的生物學(xué)行為密切相關(guān)。也有實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)miR-139-5p明顯影響骨肉瘤細(xì)胞的惡性表型，其機(jī)制通過負(fù)向調(diào)控SLITRK4、NOTCH1、GPR56、Rock1、RUNX2、DNMT1、CDK14實(shí)現(xiàn)。復(fù)習(xí)文獻(xiàn)，不難發(fā)現(xiàn)，在不同腫瘤中同一miRNA靶向調(diào)控的基因存在差別。因此，開展miRNA的功能及其靶基因的研究，單純依賴生物信息學(xué)分析是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。如何更有效開展miRNA靶基因的驗(yàn)證研究值得深入探討。必須考慮所探討的靶基因在特定組織中的表達(dá)情況，否則，所選擇的靶基因難免存在偶然性和盲目性。

本研究借助于生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫，對(duì)miR-139-5p的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，將所獲得的407個(gè)靶基因輸入DAVID6.8在線軟件，進(jìn)行信號(hào)通路富集分析，共獲得59條信號(hào)通路，其中，有21條信號(hào)通路與腫瘤有關(guān)。這些通路包括mTOR信號(hào)通路、癌癥中的蛋白多糖、小細(xì)胞肺癌、cAMP信號(hào)通路、細(xì)胞外受體相互作用、焦點(diǎn)粘連、膠質(zhì)瘤等。對(duì)富集在這些通路中的73個(gè)基因采用在線軟件string進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析。分析其節(jié)點(diǎn)后，將節(jié)點(diǎn)和周邊數(shù)據(jù)提取后導(dǎo)入Cytoscape3.8軟件構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，采用目前通用的插件MCODE計(jì)算參數(shù)，篩選出IGF1R、NOTCH1、CDH1、FOS、FN1、JUN、CDC42、CXCR4、RPS6KB1共9個(gè)基因?yàn)殛P(guān)鍵基因。

按照基因時(shí)間、空間表達(dá)的特異性，借助于HCMDB數(shù)據(jù)庫，檢索骨肉瘤癌基因數(shù)據(jù)庫分析后發(fā)現(xiàn)，在miR-139-5p調(diào)控的靶基因中的關(guān)鍵核心基因中，NOTCH1、FN1、CXCR4、RPS6KB1是在骨肉瘤中表達(dá)上調(diào)的癌基因，其他5個(gè)基因并非癌基因。其中NOTCH1作為miR-139-5p的靶基因，在骨肉瘤細(xì)胞中已經(jīng)得到實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證[3]。FN1、CXCR4、RPS6KB1較少見文獻(xiàn)報(bào)道，可作為未來進(jìn)一步深入探討的靶基因。NOTCH1作為NOTCH信號(hào)通路的分子[14]，可作為膜結(jié)合配體Jagged1、Jagged2和Delta1的受體來調(diào)節(jié)細(xì)胞的活性。NOTCH1與配體結(jié)合以后釋放其細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(NICD)，然后轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)與RBPJ/RBPSUH形成轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合物，并激活分裂位點(diǎn)增強(qiáng)子的基因，從而影響分化、增殖和凋亡程序的執(zhí)行，NOTCH也是人類腫瘤中開展靶向治療的重要靶點(diǎn)[15]。FN1是TNFSF12/TWEAK的受體，為某些細(xì)胞的弱凋亡誘導(dǎo)劑，可促進(jìn)血管生成和內(nèi)皮細(xì)胞增殖[16]，可能調(diào)節(jié)細(xì)胞與基質(zhì)蛋白的黏附。CXCR4是CXC趨化因子CXCL12/SDF-1的受體，通過增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平和促進(jìn)MAPK1/MAPK3激活來傳遞信號(hào)[17]。作為細(xì)胞外泛素的受體，CXCR4可增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平和降低細(xì)胞cAMP水平。RPS6KB1是mTOR信號(hào)通路的下游效應(yīng)分子[18]，在蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞增殖、細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞存活的調(diào)節(jié)中整合生長(zhǎng)因子信號(hào)。原發(fā)性肝癌患者中出現(xiàn)RPS6KB1高表達(dá)，往往提示預(yù)后不良[19]。因此，NOTCH1、FN1、CXCR4、RPS6KB1是miR-139-5p靶基因中的關(guān)鍵核心基因，對(duì)其進(jìn)行研究，將是揭示miR-139-5p參與人骨肉瘤細(xì)胞表型的重要突破口。

本文解析了miR-139-5p的靶基因及其調(diào)控惡性表型的分子機(jī)制，為骨肉瘤分子標(biāo)志物研究提供依據(jù)。此外，本文所建立的方法對(duì)于同類研究有一定的啟示作用。