中山地區(qū)難治性精神類疾病患者CYP2D6基因多態(tài)性及代謝表型的分布研究*

平軍嬌，章 杰，高永雙，萬 靜，杜寶國(guó)△

廣東省中山市第三人民醫(yī)院：1.精神疾病遺傳學(xué)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室；2.檢驗(yàn)科；3.早期干預(yù)科，廣東中山 528400

藥物是精神分裂癥、雙相情感障礙等重性精神類疾病的主要治療方法。目前，重性精神類疾病的藥物治療有效率僅為30%～50%，這不僅阻礙了患者的康復(fù)，同時(shí)增加了患者家庭的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。血漿藥物濃度是影響重性精神類疾病治療藥物療效和安全性的重要因素。Ⅰ相代謝和Ⅱ相代謝能力的個(gè)體差異性是維持精神類疾病治療藥物有效血藥濃度的基礎(chǔ)條件。既往研究結(jié)果證實(shí)，肝臟Ⅰ相代謝主要由細(xì)胞色素氧化酶(CYP450)和N-乙?；D(zhuǎn)移酶2(NAT2)承擔(dān)。其中，CYP450酶系及其多種同工酶參與了絕大多數(shù)精神科藥物的代謝過程[2]，而CYP2D6是其中唯一不被誘導(dǎo)產(chǎn)生的酶，參與25%臨床常用藥物的體內(nèi)代謝，包括抗精神類疾病藥和抗抑郁藥等[3]。CYP2D6的基因多態(tài)性將影響酶的活性，進(jìn)而影響藥物在個(gè)體中的不良反應(yīng)及療效。

不同個(gè)體間由于代謝表型的不同，存在代謝速度的差異，因此血藥濃度也存在個(gè)體化差異。CYP450酶系活性的個(gè)體差異受其基因多態(tài)性影響較大，在人群中CYP2D6基因多態(tài)性差異較大，目前已發(fā)現(xiàn)70多個(gè)等位基因，約130個(gè)序列變異，其中超過15個(gè)序列翻譯后為無活性的酶或者非酶，另外一些分別翻譯為活性增強(qiáng)、活性正常或活性降低的酶[4-5]。CYP2D6*1和CYP2D6*2基因型不改變酶的活性，CYP2D6*9、CYP2D6*10和CYP2D6*14基因型降低酶的活性，CYP2D6*3、CYP2D6*4、CYP2D6*6和CYP2D6*7基因型無酶活性[6-7]。對(duì)中山地區(qū)難治性精神類疾病患者進(jìn)行CYP2D6基因多態(tài)性檢測(cè)和基因分型，判定患者藥物代謝速度，合理調(diào)節(jié)藥物種類和劑量，可提高抗精神類疾病藥物使用的有效性，減少不良反應(yīng)。因此，本研究進(jìn)行了這方面的探討，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2018年1月至2020年4月在本院住院的難治性精神類疾病患者175例，對(duì)其臨床資料進(jìn)行回顧性分析，其中男113例、女62例，平均年齡(36.49±3.67)歲，居住于中山地區(qū)。根據(jù)《國(guó)際疾病分類》第10版(ICD-10)相關(guān)疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)將患者分為精神分裂癥組(A組,106例)、心境障礙組(B組,38例)和其他精神疾病組(排除精神分裂癥和心境障礙后剩余的患者，C組,31例)。其中A組男66例，女40例；B組男24例，女14例；C組男23例，女8例。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者或家屬均知情同意。

1.2方法 對(duì)CYP2D6基因rs5030865、rs5030867、rs201377835、rs35742686、rs1080985、rs5030655、rs5030862、rs1135835、rs1081003、rs5030656、rs28371706、rs1065852、rs3892097、rs28371725、rs16947和rs1135840位點(diǎn)的多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，采用Agena Bioscience Mass ARRAY DNA質(zhì)譜基因分析系統(tǒng)、Thermo Fisher Applied Biosystems 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)及飛行時(shí)間質(zhì)譜儀等進(jìn)行檢測(cè)，儀器分析系統(tǒng)和檢測(cè)由上?？道栳t(yī)學(xué)檢驗(yàn)所提供。本研究檢測(cè)的CYP2D6基因的16個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的代謝基因單倍型和酶活性變化如表1所示。CYP2D6代謝表型劃分參考臨床藥物基因組學(xué)實(shí)施聯(lián)盟(CPIC，網(wǎng)址：http://www.pharmgkb.org)，依據(jù)CPIC指南將CYP2D6藥物代謝表型分為超快代謝型、廣泛代謝型、中間代謝型和慢代謝型[8]。

表1 檢測(cè)位點(diǎn)及對(duì)應(yīng)單倍型和酶活性變化

1.2.1標(biāo)本采集 本研究采用口腔拭子采集口腔內(nèi)脫落細(xì)胞，具體操作：按照說明書的要求從采樣盒內(nèi)取出口腔拭子套管，撕開外包裝，撥開保護(hù)套，握住手柄，將棉棒頭放入口內(nèi)腮處，分別由兩側(cè)上下剮蹭并旋轉(zhuǎn)棉棒10～20次，刮取口腔內(nèi)脫落細(xì)胞，將保護(hù)套蓋回。

1.2.2標(biāo)本DNA提取與PCR擴(kuò)增 使用天根生化的基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)提取基因組DNA，具體操作步驟參照試劑盒說明書。取1.5 mL EP管配置PCR master mix[滅菌雙蒸水1.850 μL,PCR緩沖液(15 mmol/L MgCl20.625 μL),MgCl20.325 μL,dNTP 混合液0.100 μL,引物1.000 μL,HotStar Taq 0.200 μL,共4.1 μL]，選用8道或12道移液器，在384孔板的每個(gè)加樣孔中加入4 μL master mix，最后加入1 μL 基因組DNA(20 ng/μL)混勻，1 000 r/min離心1 min，小心蓋上384孔封板膜，并壓牢每個(gè)孔，防止進(jìn)行PCR時(shí)出現(xiàn)蒸發(fā)等現(xiàn)象。將PCR反應(yīng)板放置于PCR儀上，設(shè)置PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，此過程進(jìn)行45次循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

1.2.3蝦堿性磷酸酶(SAP)反應(yīng) PCR反應(yīng)結(jié)束后，將PCR反應(yīng)液中每孔加入SAP反應(yīng)液(SAP緩沖液：0.17 μL；SAP酶：0.30 μL；ddH2O：1.53 μL)，設(shè)定反應(yīng)程序?yàn)?7 ℃ 40 min，85 ℃ 5 min，4 ℃保存。

1.2.4單堿基延伸反應(yīng) 在堿性磷酸酶處理結(jié)束后，進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)，取1.5 mL EP管配置單堿基延伸反應(yīng)液EXTEND Mix(純化后PCR產(chǎn)物7 μL，iPLEX緩沖液0.2 μL，iPLEX特異性終止反應(yīng)液0.2 μL，延伸引物0.94 μL，iPLEX酶0.041 μL)，于PCR儀進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃變性5 s，52 ℃退火5 s，80 ℃延伸5 s，共進(jìn)行40次循環(huán)(其中52 ℃退火5 s及80 ℃延伸5 s進(jìn)行5次循環(huán))；最后72 ℃延伸3 min。樣本脫鹽調(diào)節(jié)及點(diǎn)樣到芯片。

1.2.5質(zhì)譜結(jié)果分析 采用Typer Analyzer軟件分析基因分型數(shù)據(jù)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或率表示，不同性別和組間基因型比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律檢驗(yàn) 對(duì)收集到的175例精神類疾病患者CYP2D6基因16個(gè)位點(diǎn)的檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律檢驗(yàn)，結(jié)果見表2。16個(gè)位點(diǎn)中14個(gè)位點(diǎn)(rs16947、rs1080985、rs5030867、rs5030656、rs201377835、rs5030862、rs28371706、rs28371725、rs1065852、rs3892097、rs1135835、rs35742686、 rs5030655和rs5030865)基因頻率的平衡檢測(cè)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有本區(qū)域群體代表性；而2個(gè)位點(diǎn)(rs1081003和rs1135840)基因頻率的平衡檢測(cè)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 CYP2D6各位點(diǎn)基因型Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)[n(%)]

各位點(diǎn)基因型的分布頻率結(jié)果顯示，rs16947位點(diǎn)主要表現(xiàn)為GG型(72.0%)，rs1135840位點(diǎn)主要表現(xiàn)為CC型(40.0%)，rs3892097位點(diǎn)主要表現(xiàn)為CC型(98.9%)，rs1065852位點(diǎn)主要表現(xiàn)為TT型(48.6%)，rs5030865位點(diǎn)主要表現(xiàn)為GG型(98.9%)，rs1080985位點(diǎn)主要表現(xiàn)為GG型(54.3%)，rs5030867位點(diǎn)主要表現(xiàn)為AA型(99.4%)，rs1081003位點(diǎn)主要表現(xiàn)為AA型(62.3%)，rs28371725位點(diǎn)主要表現(xiàn)為GG型(85.1%)，rs35742686、rs5030655和rs5030656位點(diǎn)全部表現(xiàn)為AA型(100.0%)，rs201377835、rs5030862和rs28371706位點(diǎn)全部表現(xiàn)為GG型(100.0%)，rs1135835位點(diǎn)全部表現(xiàn)為TT型(100.0%)。

續(xù)表2 CYP2D6各位點(diǎn)基因型Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)[n(%)]

2.2CYP2D6各位點(diǎn)等位基因分布 175例患者16個(gè)CYP2D6基因多態(tài)性位點(diǎn)等位基因分布頻率見表3。rs1135840和rs3892097位點(diǎn)等位基因主要為C型(53.7%、99.4%)，rs1065852位點(diǎn)等位基因主要為T型(67.1%)，rs5030867和rs1081003位點(diǎn)等位基因主要為A型(99.4%和72.9%)，rs16947、rs5030865、rs1080985和rs28371725位點(diǎn)等位基因主要為G型(84.6%、99.4%、71.4%和91.7%)，rs35742686、rs5030656和rs5030655位點(diǎn)等位基因全部為A型(100.0%)，rs201377835、rs5030862和rs28371706位點(diǎn)等位基因全部為G型(100.0%)，rs1135835位點(diǎn)等位基因全部為T型(100.0%)。

表3 CYP2D6各位點(diǎn)等位基因分布頻率[n(%)]

2.3CYP2D6各位點(diǎn)基因型在不同性別間的分布 分析CYP2D6不同多態(tài)性位點(diǎn)的基因型在男女患者之間分布發(fā)現(xiàn)，不同基因型在男性和女性之間分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表4。

表4 CYP2D6各位點(diǎn)基因型在不同性別間的分布[n(%)]

2.4CYP2D6各位點(diǎn)基因型在不同組間的分布 分析CYP2D6基因位點(diǎn)rs16947、rs1135840、rs3892097、rs1065852、rs5030865、rs1080985、rs35742686、rs5030655、rs5030867、rs5030656、rs201377835、rs5030862、rs28371706、rs1081003、rs1135835和rs28371725不同基因型在A、B、C組間比較，P值分別為0.787、0.294、0.545、0.957、0.999、0.524、0.999、0.999、0.999、0.999、0.999、0.999、0.999、0.891、0.999、0.274，分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.5CYP2D6基因表型在不同組間分布 分析CYP2D6基因表型在不同組間的分布發(fā)現(xiàn)，4種基因表型(超快代謝型、廣泛代謝型、中間代謝型和慢代謝型)在A、B、C組間比較，分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=13.127,P=0.041)。進(jìn)行性別分層統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，基因表型性別間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，其中超快代謝型χ2=1.742,P=0.187；廣泛代謝型χ2=2.114,P=0.348；中間代謝型χ2=1.193,P=0.908；慢代謝型χ2=0.000,P=0.999)。

續(xù)表4 CYP2D6各位點(diǎn)基因型在不同性別間的分布[n(%)]

3 討 論

抗精神類疾病藥物在肝臟內(nèi)多經(jīng)CYP450代謝，CYP2D6作為第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)的、目前研究較多的藥物代謝酶基因，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其等位基因多達(dá)100個(gè)，已命名的達(dá)70個(gè)[9-10]，其對(duì)應(yīng)酶活性正常、酶活性下降、酶活性升高和酶活性缺失4種功能表型[11]，CYP2D6*1和*2為酶活性正常的單倍型，CYP2D6*9、*10、*14B、*17和*41為酶活性降低的單倍型，CYP2D6*3、*4 、*6、*7、*11、*12和*15為酶活性缺失的單倍型[12]。CYP2D6等位基因在不同國(guó)家、地區(qū)及種族中的分布不同，CYP2D6*10在中國(guó)、韓國(guó)和日本等亞洲人群中的等位基因頻率為40%～50%，而在歐美國(guó)家人群中頻率較低；CYP2D6*4在歐美國(guó)家人群中的等位基因頻率為20%，而在亞洲人群中等位基因頻率較低，僅為0～2%[13-14]。本研究針對(duì)中國(guó)廣東省中山地區(qū)難治性精神類疾病患者CYP2D6基因16個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行了研究，其中CYP2D6*10的兩個(gè)基因多態(tài)性位點(diǎn)rs1081003和rs1135840的基因頻率平衡檢測(cè)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，不符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，提示rs1081003和rs1135840兩個(gè)基因多態(tài)性位點(diǎn)可能與精神類疾病有一定的關(guān)聯(lián)性。

在本研究中CYP2D6*10(rs1065852)為16個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)中最常見的突變等位基因，T型等位基因頻率為67.1%，高于白種人[15]，也高于既往研究的中國(guó)、日本等亞洲人群CYP2D6*10等位基因頻率[16-18]，提示rs1065852位點(diǎn)T型等位基因可能是精神類疾病的易感基因，這將在后續(xù)的病例對(duì)照研究中進(jìn)行驗(yàn)證。表3結(jié)果顯示，本研究中CYP2D6*4(rs3892097)T型等位基因頻率為0.6%，這與既往在亞洲人群中的研究結(jié)果一致[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，CYP2D6*14B(rs5030865)突變率較低，為0.6%，低于張仁云等[19]的研究結(jié)果，這將在后續(xù)加大樣本量進(jìn)行研究驗(yàn)證。本研究未發(fā)現(xiàn)CYP2D6基因rs35742686、rs5030656、rs5030655、rs201377835、rs5030862、rs28371706和rs1135835位點(diǎn)出現(xiàn)突變。

國(guó)內(nèi)外關(guān)于CYP450代謝表型的性別差異的研究較少，一些研究發(fā)現(xiàn)女性CYP2D6的酶活性高于男性，但也有一些研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)CYP2D6的酶活性在男性中更高或不存在性別差異[20-21]。而本研究在CYP2D6基因型和代謝表型分析中未發(fā)現(xiàn)性別間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但本研究發(fā)現(xiàn)精神分裂癥患者、心境障礙患者和其他精神類疾病患者在代謝表型中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，本研究結(jié)果可為精神科個(gè)體化用藥提供數(shù)據(jù)參考。