高效液相色譜法同時測定功勞木藥材中9 種化學成分含量*

黃 洋

（廣州醫科大學藥學院·廣東省分子靶標與臨床藥理學重點實驗室，廣東 廣州 511436）

功勞木Mahoniae Caulis為小檗科植物闊葉十大功勞Mahonia bealaei（Fort.）Carr.和細葉十大功勞Mahonia fortunei（Lindl.）Fedde 的干燥莖［1］，富含生物堿、黃酮等化學成分，有清熱燥濕、瀉火解毒等功效［2］，具有抗炎［3］、抗腫瘤［4］、抗氧化［5-6］、抗乙酰膽堿酯酶［7-8］等藥理作用。2020 年版《中國藥典（一部）》中質量控制項采用高效液相色譜（HPLC）法測定功勞木藥材中非洲防己堿、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿含量［1］。本研究中采用HPLC法測定不同產地27批功勞木藥材中化學成分氯化木蘭花堿、綠原酸、小檗胺、四氫藥根堿、非洲防己堿、鹽酸藥根堿、粉防己堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的含量，旨在加強功勞木藥材質量的全面控制。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC - 20A 型高效液相色譜儀（日本Shimadzu 公司）；XS 105 DU 型十萬分之一電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；SB25- 12DT 型超聲儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Milli-Q Academic 型超純水凈化系統（美國Millipore 公司）；RT-04A 型高速粉碎機（香港泓荃制藥機械公司）。

1.2 試藥

鹽酸藥根堿對照品（批號110733 - 201609，含量89.5%），粉防己堿對照品（批號110711-201810，含量99.6%），鹽酸巴馬汀對照品（批號110732-201609，含量86.8%），鹽酸小檗堿對照品（批號110713-201613，含量86.8%），綠原酸對照品（批號110753-201716，含量99.3%），四氫藥根堿對照品（批號13063-54-2，含量98.0%），均購自中國食品藥品檢定研究院；非洲防己堿對照品（批號18041021，含量98.0%），小檗胺對照品（批號18040922，含量98.0%），氯化木蘭花堿對照品（批號18041024，含量98.0%）均購自上海同田生物技術有限公司；甲醇、乙腈均為色譜純，水為超純水。27 批（編號依次為S1-S27）功勞木藥材樣品信息見表1，經深圳市藥品檢驗研究院中藥室和韶關學院鄧偉先教授鑒定為闊葉十大功勞Mahonia bealaei（Fort.）Carr.。

表1 功勞木藥材樣品信息Tab.1 Information of Mahoniae Caulis

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters XBridge C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：0.1%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0 min 時5%B，17 min 時17% B，35 min 時20% B，50 min 時23% B，60 min 時50% B，70.1 min時100%B，80.1 min 時5%B，90 min 時5%B；流速：1.0 mL/min；檢測波長：210 nm；柱溫：25°C；進樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

取藥材樣品適量，粉碎，過3 號篩，稱取粗粉約0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入鹽酸-甲醇溶液（1∶100，V/V）50 mL，密塞，稱定質量，超聲（功率為500W，頻率為40 kHz）處理45 min，取出，放冷，再稱定質量，用鹽酸-甲醇溶液（1∶100，V/V）補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。分別稱取氯化木蘭花堿、綠原酸、小檗胺、四氫藥根堿、非洲防己堿、鹽酸藥根堿、粉防己堿、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀對照品適量，精密稱定，置5 mL 容量瓶中，分別加鹽酸-甲醇（1∶100，V/V）溶解并定容，搖勻，作為單一對照品貯備液。分別精密吸取各適量，用鹽酸-甲醇（1∶100，V/V）定容，得含氯化木蘭花堿82.72 μg / mL、綠原酸60.48 μg/ mL、小 檗 胺10.65 μg/ mL、四氫藥根堿16.62 μg/mL、非洲防己堿50.68 μg/mL、鹽酸藥根堿277.13 μg/ mL、粉防己堿40.14 μg/ mL、鹽酸小檗堿406.78 μg/ mL、鹽酸巴馬汀340.47 μg/ mL 的混合對照品溶液。以鹽酸- 甲醇溶液（1∶100，V/V）作為空白溶劑。

2.3 方法學考察

系統適用性試驗：分別取2.2 項下3 種溶液各適量，按2.1 項下色譜條件進樣測定。結果供試品溶液色譜中，在與混合對照品溶液相同保留時間處有相應色譜峰，目標峰分離良好，且空白溶劑無干擾。詳見圖1。

線性關系考察：精密量取2.2 項下混合對照品溶液，分別稀釋2，4，8，16，32，64倍，得系列混合對照品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，以待測成分質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程，詳見表2。

表2 線性關系考察結果（n=6）Tab.2 Results of the linear relation test（n=6）

精密度試驗：取2.2 項下混合對照品溶液適量，按2.1 項下色譜條件連續進樣6 次，記錄峰面積。結果見表3，表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：按2.2 項下方法制備供試品溶液，室溫下分別于制備后0，4，8，12，24，48 h 按2.1 項下色譜條件各進樣3 次，記錄峰面積。結果見表3，表明室溫下供試品溶液在48 h內穩定性良好。

重復性試驗：取2.2 項下供試品溶液，按2.1 項下色譜條件連續進樣測定6 次，記錄峰面積。結果見表3，表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：稱取已知含量的藥材樣品0.125 g，精密稱定，分別精密加入一定量的相應對照品，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，重復3次。記錄色譜圖，并計算加樣回收率。結果見表3。

表3 精密度、穩定性、重復性及加樣回收試驗結果Tab.3 Results of the precision，stability，repeatability and recovery tests（%）

2.4 樣品含量測定

取各批次藥材樣品適量，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算9 個化學成分含量，結果見表4。氯化木蘭花堿、綠原酸、小檗胺、四氫藥根堿、非洲防己堿、鹽酸藥根堿、粉防己堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的含量范圍分別為1.17～7.45 μg/ mg、0.01～0.96 μg/ mg、0.01～0.25 μg/mg、0.02～0.35 μg/mg、0.16～3.12 μg/mg、2.33～11.62 μg/mg、0～3.77 μg/mg、3.04～9.78 μg/mg、1.34～11.54 μg/mg。

表4 27批藥材樣品中9種化學成分的含量測定結果（mg/mg）Tab.4 Results of content determination of nine compounds in 27 batches of Mahoniae Caulis（mg/mg）

1.氯化木蘭花堿 2.綠原酸 3.小檗胺 4.四氫藥根堿 5.非洲防己堿 6.鹽酸藥根堿 7.粉防己堿 8.鹽酸巴馬汀 9.鹽酸小檗堿A.混合對照品溶液 B.供試品溶液 C.空白溶劑圖1 高效液相色譜圖1.Magnoflorine chloride 2.Chlorogenic acid 3.Berbamine 4.Corypalmine 5.Columbamine 6.Jatrorrhizine hydrochloride 7.Tetrandrine 8.Palmatine hydrochloride 9.Berberine hydrochloride.A.Mixed reference solution B.Test solution C.Blank solventFig.1 HPLC chromatograms

3 討論

3.1 試驗條件優化

參考課題組前期關于功勞木藥材的分析條件［9-12］，預試驗中比較了來自不同廠家的4款C18柱，從保留時間和選擇性的角度，最終以Waters 公司的C18柱作為最優固定相；通過二極管陣列檢測器對功勞木藥材提取物進行全波長掃描，結果在210 nm波長處能得到最佳峰形和信號圖譜，故選擇210 nm 作為分析波長；考慮到部分色譜峰的分離度欠佳，參考相關文獻，選擇磷酸作為添加劑用于峰形的優化，比較了不同質量分數的磷酸對功勞木藥材提取物中化合物的分離效果，發現其質量分數為0.1%時，分離效果最佳。研究中還發現，溫度對色譜峰的分離度也有一定影響，從分離度的角度考慮，最終選擇25°C，此時大部分峰的分離度最佳。

3.2 測定結果分析

2020 年版《中國藥典（一部）》中僅收載了功勞木藥材中4種混合對照品（非洲防己堿、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿）的含量測定。從檢測結果來看，27 批功勞木藥材樣品中該4種化學成分的含量也相對穩定，再次驗證了收集到的功勞木藥材的真實性和準確性。

3.3 方法評價

中藥發揮作用常是多種成分整體協同作用的結果，但由于中藥的復雜性，對其物質基礎的認識尚未統一［13-15］。現有標準中僅對個別含量高的成分進行檢測，并不能反映中藥的整體觀，故有必要通過多指標含量測定，并根據發揮作用的藥效物質，選擇合適的藥材產地。本研究中通過對來自不同產地的27 批功勞木藥材中9種化學成分的含量分析，可為功勞木藥材質量標準的提升提供參考。