復(fù)方營(yíng)養(yǎng)混懸劑中鐵元素的測(cè)定及其不確定度評(píng)定*

李 瀟，周長(zhǎng)明，丁 銳，邵天舒，王 靜

（北京市藥品檢驗(yàn)研究院·國(guó)家藥品監(jiān)督管理局仿制藥研究與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室·中藥成分分析與生物評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206）

復(fù)方營(yíng)養(yǎng)混懸劑的處方包括酪蛋白、必需脂肪酸、維生素、礦物質(zhì)、微量元素等，在臨床屬整蛋白型腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)劑。現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中無(wú)鐵元素含量測(cè)定項(xiàng)，但嚴(yán)重?zé)齻㈤L(zhǎng)時(shí)間腹瀉、血液透析等患者的鐵等微量元素缺失較多［1］，故應(yīng)測(cè)定復(fù)方營(yíng)養(yǎng)混懸劑中鐵元素的含量。本研究中根據(jù)《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》對(duì)鐵元素含量測(cè)定進(jìn)行了不確定度分析，并確定其不確定度的影響因素，為該制劑的質(zhì)量控制提供量化評(píng)價(jià)指標(biāo)［2-10］。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

ICE 3500 型原子吸收光譜儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）；XA205DU 型電子天平（梅特勒- 托利多國(guó)際貿(mào)易＜上海＞有限公司）；ETHOS One 型微波消解儀（意大利Milestone公司）。

1.2 試藥

復(fù)方營(yíng)養(yǎng)混懸劑（A 公司，批號(hào)分別為1709002，1709003，1709004；B公司，批號(hào)分別為190803，190202，190204）；鐵單元素溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)［中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院，質(zhì)量濃度為100 μg/ mL，編號(hào)為GBW（E）080123，批號(hào)為19042］；濃硝酸為優(yōu)級(jí)純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗(yàn)條件

波長(zhǎng)：248.3 nm；燃?xì)饬髁浚?.9 L / min；通帶：0.2 nm；霧化器提升時(shí)間：4 s；燃燒器高度：7.0 mm。

2.2 測(cè)定方法

2.2.1 溶液制備

精密量取鐵單元素溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（100 μg/ mL）10 mL，置100 mL 容量瓶中，用水定容，搖勻，即得對(duì)照品溶液。稱(chēng)取復(fù)方營(yíng)養(yǎng)混懸劑0.5 g，精密稱(chēng)定，置聚四氟乙烯消解罐中，加入濃硝酸8 mL，擰緊蓋子，放置1 h，微波消解程序見(jiàn)表1。消解完畢后，取出，置電熱板上加熱至硝酸1 mL，冷卻，將消化液移至20 mL容量瓶中，用少量水洗滌3～4 次，合并洗滌液，置容量瓶中，加水定容，搖勻，即得供試品溶液。以1.8%硝酸溶液作為空白對(duì)照溶液。

表1 微波消解程序Tab.1 Microwave digestion procedure

2.2.2 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：精密量取2.2.1 項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.25，0.5，1，3，4，6，12 mL，分別置20 mL 容量瓶中，用水定容，按2.1 項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄儀器信號(hào)強(qiáng)度。以鐵元素質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、儀器信號(hào)強(qiáng)度（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=0.035 14X+ 0.003 86（r= 0.998 7，n= 7）。結(jié)果表明，鐵元素質(zhì)量濃度在0.125～6 μg/ mL 范圍內(nèi)與儀器信號(hào)強(qiáng)度的線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取2.2.1項(xiàng)下供試品溶液適量，按2.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件試驗(yàn)3 d，每天進(jìn)樣2 次測(cè)定，記錄儀器信號(hào)強(qiáng)度。結(jié)果的RSD小于2.0%（n= 6），表明方法精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：稱(chēng)取樣品（批號(hào)為190803）適量，精密稱(chēng)定，共6 份，按2.2.1 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1 項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄儀器信號(hào)強(qiáng)度，并計(jì)算含量。結(jié)果鐵元素平均含量為39.535 2 μg/ g，RSD為2.27%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品（批號(hào)為190803）適量，共9 份，分別加入低、中、高質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，按2.2.1 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1 項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄儀器信號(hào)強(qiáng)度，并計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）Tab.2 Results of the recovery test（n=9）

2.2.3 耐用性試驗(yàn)

按2.2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，改變?cè)游展庾V儀帶寬和燃?xì)馔浚渌麉?shù)不變，測(cè)定鐵元素含量。結(jié)果見(jiàn)表3，在不同條件下測(cè)定鐵元素含量的RSD為3.05%，表明帶寬和燃?xì)馔繉?duì)測(cè)定結(jié)果影響較小，該方法耐用性較好。

表3 耐用性試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of the durability test

2.2.4 樣品含量測(cè)定

取6 批樣品各適量，分別按2.2.1 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1 項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，平行測(cè)定3 次，記錄儀器信號(hào)強(qiáng)度，并計(jì)算樣品含量。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=3）Tab.4 Results of content determination of iron element in the samples（n=3）

2.3 不確定度數(shù)學(xué)模型

根據(jù)公式X=(C×V× 10-6)/(W× 10-3)建立模型，由此討論各分量的不確定度。式中，X為樣品中鐵元素的含量（mg/ kg）；C為由回歸方程得待測(cè)元素的質(zhì)量濃度（μg/mL）；V為樣品溶液定容體積（mL）；W為樣品質(zhì)量（g）。

2.4 測(cè)量不確定度評(píng)定

2.4.1 樣品稱(chēng)量引起的不確定度（uw，rel）

樣品稱(chēng)量使用的儀器為萬(wàn)分之一電子天平，該儀器校準(zhǔn)證書(shū)顯示允許誤差為±0.1 mg，按矩形分布，k=

2.4.2 樣品溶液定容引起的不確定度（ut，rel）

樣品消解后，用水轉(zhuǎn)移并定容至20 mL A 級(jí)容量瓶中。不確定度包括容量瓶的校準(zhǔn)不確定度和溶液溫度引起的不確定度。其不確定度根據(jù)《JJG 196—2006》（常用玻璃量器檢定規(guī)程）的規(guī)定，20 mL A 級(jí)容量瓶20 ℃時(shí)允許誤差為± 0.02 mL，按矩形分布計(jì)算，為ut，1= 0.02 ÷= 0.012 mL。容 量 瓶 的 校 準(zhǔn) 溫 度 為20 ℃，一般情況下，實(shí)驗(yàn)室溫差為3 ℃，水體積膨脹系數(shù)為2.1× 10-4/℃。由此計(jì)算出由實(shí)驗(yàn)室溫差造成的不確定度為ut，2= 20 × 3× 2.1× 10-4÷= 0.007 mL。因此，樣品溶液定容的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度經(jīng)計(jì)算為

2.4.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引起的不確定度

本研究中所用鐵元素溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)中，標(biāo)明其擴(kuò)展不確定度（u）為0.8%，擴(kuò)展因子k=2。因此，由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)本身引起的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為us=0.8%÷2=4×10-4。

2.4.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液引起的不確定度

標(biāo)準(zhǔn)溶液引起的不確定度up包括配制標(biāo)準(zhǔn)溶液、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合和結(jié)果重復(fù)測(cè)定產(chǎn)生的不確定度。

1）配制標(biāo)準(zhǔn)溶液引起的不確定度

標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋的不確定度主要為容量瓶和移液管引起的不確定度，包括校準(zhǔn)的不確定度及溫度效應(yīng)的不確定度。本研究中標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋過(guò)程中會(huì)使用到100 mL、20 mL A 級(jí)容量瓶，0.5 mL、1 mL、3 mL A 級(jí)單標(biāo)線移液管，5 mL、10 mL A級(jí)刻度移液管。

（1）容量瓶引起的不確定度

①100 mL A 級(jí)容量瓶：允許誤差為± 0.10 mL；矩形分布，k=，則100 mL容量瓶引起的校準(zhǔn)不確定度為u100，1= 0.1÷= 0.058 mL。溶液的實(shí)際溫度與校正時(shí)溫度的差值引起的不確定度。容量瓶的校準(zhǔn)溫度為20 ℃，一般情況下實(shí)驗(yàn)室溫差為3 ℃，水體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃，由此計(jì)算出實(shí)驗(yàn)室溫差引起的不確定度為u100，2=100×3×2.1×10-4÷=0.036 mL。

②20 mL A 級(jí)容量瓶：允許誤差為± 0.02 mL；矩形分布，k=，則20 mL 容量瓶引起的校準(zhǔn)不確定度為u20，1=0.02 ÷=0.012 mL。

容量瓶的校準(zhǔn)溫度為20 ℃，一般情況下實(shí)驗(yàn)室溫差為3 ℃，水體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃，因此溫度引起的不確定度為u20，2= 200 × 3× 2.1× 10-4÷=0.007 3 mL。

因此，由100 mL、20 mL A 級(jí)容量瓶引起的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為

（2）單標(biāo)線移液管引起的相對(duì)不確定度

①0.5 mL A級(jí)單標(biāo)線移液管：允許誤差為±0.006 mL，故u0.5，1=0.006 ÷=0.003 5 mL；一般情況下，實(shí)驗(yàn)室溫差為3 ℃，故u0.5，2= 0.5× 3× 2.1× 10-4÷=1.8×10-4mL。故0.5 mL 單標(biāo)線移液管移取0.5 mL 溶液的相對(duì)不確定度為0.007。

②1 mL A級(jí)單標(biāo)線移液管：允許誤差為± 0.007 mL，故；一般情況下，實(shí)驗(yàn)室溫差為3 ℃，故10-4mL 。故1 mL 單標(biāo)線移液管移取1.0 mL 溶液的相對(duì)不確定度為

③3 mL A級(jí)單標(biāo)線移液管：允許誤差為± 0.015 mL，故u3，1= 0.015 ÷= 0.008 7 mL；一般情況下實(shí)驗(yàn)室 溫 差 為3 ℃，故0.001 1 mL。故3 mL 移液管移取3.0 mL 溶液的相對(duì)不確定度為

（3）刻度移液管引起的相對(duì)不確定度

①5 mL A 級(jí)刻度移液管：允許誤差為±0.025 mL；故；一般情況下，實(shí)驗(yàn)室溫差為3 ℃，故故5 mL 刻度移液管移取4.0 mL 溶液的相對(duì)不確定度為

②10 mL A級(jí)刻度移液管：允許誤差為±0.05 mL，故；一般情況下，實(shí)驗(yàn)室溫差為3 ℃，故DTY 10 mL 刻度移液管移取6.0 mL 溶液的相對(duì)不確定度為

鐵元素標(biāo)準(zhǔn)溶液制備過(guò)程中使用100 mL容量瓶1次，20 mL 容量瓶5 次，0.5 mL 移液管1 次，1 mL 移液管1 次，3 mL 移液管1 次，5 mL 刻度吸管1 次，10 mL 刻度吸管1 次。因此，配制鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液引起的不確定度為，

2）標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引起的不確定度

由標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的S可由下式表示：

式中，B為斜率；SR為標(biāo)準(zhǔn)曲線的剩余標(biāo)準(zhǔn)差（殘差的標(biāo)準(zhǔn)差）；n為標(biāo)準(zhǔn)曲線的點(diǎn)數(shù)（n=5）；p為樣品的重復(fù)測(cè)定次數(shù)（p=6）；C為樣品的平均值；C0為回歸曲線各點(diǎn)質(zhì)量濃度的平均值；C0j為標(biāo)準(zhǔn)溶液各點(diǎn)的質(zhì)量濃度；Aaj為標(biāo)準(zhǔn)溶液各點(diǎn)的響應(yīng)值；Aj為根據(jù)回歸曲線計(jì)算的理論值。結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引起的不確定度Tab.5 Uncertainty caused by the standard curve fitting

3）結(jié)果重復(fù)測(cè)定產(chǎn)生的不確定度

在本試驗(yàn)條件下，對(duì)復(fù)方營(yíng)養(yǎng)混懸劑進(jìn)行了6次平行測(cè)定，計(jì)算其平均值C0及S。按照A 類(lèi)不確定度評(píng)定，鐵元素由重復(fù)性引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度us，rel=S÷(C0×)=0.013 9÷（0.819 1×）=0.041 6。結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 結(jié)果重復(fù)測(cè)定產(chǎn)生的相對(duì)不確定度Tab.6 Results of the relative uncertainty caused by the repeatability test

2.4.5 供試品溶液中鐵元素質(zhì)量濃度的合成不確定度

2.4.6 供試品中鐵元素含量的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

相對(duì)不確定度分量見(jiàn)表7。

表7 相對(duì)不確定度分量匯總Tab.7 Weight summary of relative standard uncertainty

標(biāo)準(zhǔn)不確定度為uc=urel×C；其中C為供試品鐵元素含量（μg/g）。uc=0.042 0×39.535 2=1.660 5。取包含因子k=2，此時(shí)對(duì)應(yīng)的置信概率為95%，擴(kuò)展不確定度U=k×uc=3.321 0。

2.4.7 評(píng)定結(jié)果

采用原子吸收光譜法測(cè)定復(fù)方營(yíng)養(yǎng)混懸劑中鐵元素的含量，樣品量為0.5 g 時(shí)，鐵元素測(cè)定結(jié)果為（39.535 2±3.321 0）μg/g，置信概率為95%，k=2。

3 討論

復(fù)方營(yíng)養(yǎng)混懸劑主要用于嚴(yán)重創(chuàng)傷、消耗性疾病或術(shù)后營(yíng)養(yǎng)不足的補(bǔ)充及腫瘤放射治療或化學(xué)治療的支持治療，由于大多為重癥疾病，所以微量元素在其中有重要作用，但在該產(chǎn)品現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中均無(wú)鐵元素含量的測(cè)定方法。在同類(lèi)產(chǎn)品中，部分采用先放置石英坩堝中熾灼至無(wú)煙，然后在550 ℃熾灼至灰白色的方法［11-13］。本產(chǎn)品使用該方法的重復(fù)性欠佳，可能由于熾灼的過(guò)程為開(kāi)放體系，而鐵元素在本產(chǎn)品中含量較低（38 mg/kg），在熾灼過(guò)程中易損失，導(dǎo)致結(jié)果不穩(wěn)定，故未嘗試。

本研究中所用微波消解法為封閉體系，樣品不易損失，重復(fù)性、回收率、線性和耐用性試驗(yàn)結(jié)果均較好。同時(shí)，對(duì)該方法的不確定度做了分析，發(fā)現(xiàn)不確定度主要來(lái)源于樣品溶液的定容和標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和樣品的稱(chēng)量對(duì)不確定度的影響較小，故在試驗(yàn)中應(yīng)注意。