花椒根總生物堿抗腫瘤活性研究*

龍奕霄，蒙 永，蔣 霞

（1.廣西醫科大學，廣西 南寧 530021； 2.廣西壯族自治區梧州市紅十字會醫院，廣西 梧州 543002；3.廣西醫科大學第一附屬醫院，廣西 南寧 530021）

花椒根為蕓香科花椒屬植物花椒Zanthoxylum bun?geanumMaxim.的根，收錄于《本草綱目》《中華本草》《本草從新》等中藥名著，有散寒、除濕、止痛、殺蟲等功效，主治虛寒血淋、風濕痹痛、胃痛、牙痛、痔瘡、濕瘡、腳氣、蛔蟲病等癥［1］。花椒根含有多種生物堿類成分［2-5］，民間曾用于宮頸癌的治療。本研究中探討了花椒根總生物堿對腫瘤細胞生長的抑制作用。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀器：DHG-9053A 型電熱鼓風干燥箱（無錫瑪瑞特科技有限公司）；UV-8000 型紫外-可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）；Synergy H1型多功能檢測儀（美國Biotek 公司）；DMi8 型顯微鏡成像系統、EG150H+C型自動組織包埋機、RM2255型半自動輪轉切片機（德國Leica公司）；Multiskan Go型全波長全自動多功能酶標儀（美國Thermo Fisher 公司）；JK-6型生物組織攤烤片機（武漢俊杰電子有限公司）。

試藥：白屈菜紅堿對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為111718-201402，供含量測定用）；D113 型大孔弱酸性苯丙烯系陽離子交換樹脂（天津市津達正源節能環保科技有限公司）；溴甲酚綠（天津博迪化工股份有限公司）；氟尿嘧啶注射液（上海旭東海普藥業有限公司，批號為FA151117）；白細胞介素2（IL-2）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）小鼠酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（北京科盈美公司，批號分別為19052511，19062513）；Tunel 細胞凋亡檢測試劑盒（批號為031819190506）、Proteinase K（批號為111318190402）購自上海碧云天生物技術有限公司；其余試劑均為分析純，水為純化水。花椒根藥材，采自廣西壯族自治區南寧市武鳴區大明山，經梧州市紅十字會醫院梁海雄副主任中藥師鑒定為正品。

動物：H22腹腔積液型種鼠，雌雄各半，購自廣東省醫學實驗動物中心，實驗動物生產許可證號為SCXK（粵）2013-0002；SPF 級KM 小鼠，體質量18～22 g，雌雄各半，購自廣西醫科大學動物實驗中心，實驗動物生產許可證號為SCXK（桂）2014-0002，實驗動物使用許可證號為SYXK（桂）2014-0003。飼養溫度24～27 ℃，相對濕度40%～70%，自然光照，自由攝食飲水，實驗動物飼養及處理符合實驗動物倫理學要求。

1.2 方法

1.2.1 供試品溶液制備［6-7］

取藥材樣品5.0 kg，粉碎，過60目篩，加氨水攪拌并使其充分浸潤，放置12 h后，加8倍量氯仿回流提取3次，每次2 h，濾過，回收溶劑，濃縮成浸膏，加2%鹽酸溶液溶解，過濾后濾液加氯仿溶液萃取，棄去氯仿液，酸水液過弱酸性陽離子交換樹脂，水洗至洗脫液近無色，棄去水洗液，15%醋酸-80%乙醇洗脫，洗脫液回收，濃縮，干燥，得花椒根總生物堿提取物（54.57%）。

質量控制：參考文獻［4］配制溴甲酚綠磷酸緩沖液，以白屈菜紅堿質量濃度（C）為橫坐標、吸光度（A）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程。采用紫外-可見分光光度法，以白屈菜紅堿為對照，測定并分離所得花椒根總生物堿提取物中的生物堿類成分含量，計算樣品中總生物堿含量。

1.2.2 小鼠急性毒性實驗［8］

實驗分為①組、②組、③組、④組、⑤組、⑥組，各10 只，分別灌胃1 000，800，640，512，410，328 g/kg 花椒根總生物堿1 次（每10 g 體質量灌胃0.2 mL）。記錄24 h 內小鼠死亡數量及死亡表現癥狀（見表1），經Bliss擬合計算半數致死濃度（LD50）。未死亡小鼠觀察14 d，記錄飲食、行為及體格變化。

表1 小鼠急性毒性實驗觀察項目Tab.1 Observation items of the acute toxicity test in mice

1.2.3 抗腫瘤活性

分組及給藥：無菌條件下抽取傳代第7天H22小鼠的腹腔積液，用生理鹽水稀釋成密度為5×106mL-1的單細胞懸液。將60 只KM 小鼠隨機分為正常對照組（A組，等體積生理鹽水灌胃）、模型組（B 組，等體積生理鹽水灌胃）、陽性藥物組（C 組，氟尿嘧啶20 mg/kg 腹腔注射）及花椒根總生物堿高、中、低劑量組（D1組、D2組、D3組，100，80，40 g/kg生藥灌胃），各10只。右上肢腋窩皮下注射0.2 mL 細胞懸液以復制荷瘤小鼠模型，建模成功后各組小鼠給予相應藥物或生理鹽水，每天1 次，連續10 d。

組織病理形態學：取瘤塊，稱定質量，置10%甲醛溶液中固定，常規病理包埋，切4 μm 厚片，蘇木素-伊紅（HE）染色，顯微鏡下觀察組織病理形態學。細胞凋亡率計算：上述切片以Tunel 法觀察細胞凋亡情況。每組每個移植瘤組織隨機拍攝3 個視野，各視野圖片用Image-Pro Plus 6.0 軟件統計，視野內細胞凋亡陽性表達占全視野的百分比為每張圖片的細胞凋亡率［9］。抑瘤率計算：摘眼球取血后頸椎脫臼處死小鼠，剝取瘤塊，稱定質量，計算抑瘤率（IR）。IR=（模型組平均瘤體質量-用藥組平均瘤體質量）/模型組平均瘤體質量×100%。

細胞因子水平：末次給藥后24 h，記錄各組小鼠體質量，摘眼球取血，3 500 r/min 離心10 min，分離，得血清。以ELISA法檢測小鼠血清中的IL-2和TNF-α水平。

1.3 統計學處理

采用SPSS 16.0 統計學軟件分析。計量資料以X±s表示，行t檢驗。P ＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 急性毒性實驗

①組、②組、③組、④組、⑤組、⑥組小鼠分別死亡7，6，2，1，0，0 只，LD50為778.21 g/kg。后續實驗中的高、中、低劑量根據1/5，1/10，1/20LD50設定，按調湊整原則生藥量分別設定為100，80，40 g/kg。剩余未死亡小鼠繼續觀察14 d，各動物體表毛色正常，攝食、飲水、排泄及活動正常。

2.2 組織病理形態學

B組腫瘤細胞數目多，排列緊密，細胞核深染；C組、D1組、D2組、D3組腫瘤細胞胞核固縮、胞質疏松，可見凋亡、壞死的腫瘤細胞。詳見圖1。

圖1 各組小鼠腫瘤組織病理形態學變化（HE，×200）Fig.1 Histopathology of tumor tissue of mice in each group（HE staining，×200）

2.3 細胞凋亡

B 組移植瘤凋亡細胞核呈棕色或黑色陽性表達，細胞核突出于細胞邊緣，未凋亡細胞核為藍色；C 組、D1組、D2組移植瘤組織凋亡細胞顯著增多，凋亡率顯著升高（P＜0.01）。詳見表2和圖2。

圖2 各組小鼠移植瘤細胞凋亡情況（Tunel，×400）Fig.2 Apoptosis of transplanted tumor in each group（Tunel staining，×400）

2.4 抑瘤率

與B組比較，C組及D1組荷瘤小鼠瘤體質量顯著降低（P ＜0.01或P ＜0.05）；各用藥組抑瘤率見表2。

表2 各組抑瘤率及細胞凋亡率比較（±s，n=10）Tab.2 Comparison of tumor inhibition rate and apoptosis rate in each group（±s，n=10）

表2 各組抑瘤率及細胞凋亡率比較（±s，n=10）Tab.2 Comparison of tumor inhibition rate and apoptosis rate in each group（±s，n=10）

注：與B組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。表3同。Note：Compared with those in group B，*P ＜0.05，**P ＜0.01（for Tab.2-3）.

組別B組C組D1組D2組D3組劑量（g/kg）0.02 100 80 40體質量（g）實驗前21.03±1.16 21.62±2.05 20.65±1.37 20.73±1.21 20.27±1.33實驗后29.46±4.80 26.37±5.13*29.75±6.20 30.08±4.90 30.71±3.17瘤體質量（g）1.87±0.21 0.87±0.38**1.18±0.64*1.68±0.71 1.83±0.59抑瘤率（%）53.26 36.85 10.29 2.18細胞凋亡率（%）5.21±1.16 18.57±2.42**17.66±2.81**10.08±1.95**6.47±1.20

2.5 血清IL-2 和TNF-α 水平

與A組比較，B組小鼠血清IL-2和TNF-α水平均顯著降低（P ＜0.01）；與B組比較，D1組小鼠血清IL-2水平顯著升高（P ＜0.05），C 組、D1組及D2組小鼠血清TNF-α水平均顯著升高（P ＜0.01）。詳見表3。

表3 各組小鼠血清中IL-2和TNF-α水平比較（±s，pg/mL n=10）Tab.3 Comparison of serum IL-2 and TNF-α levels in each group（±s，pg/mL，n=10）

表3 各組小鼠血清中IL-2和TNF-α水平比較（±s，pg/mL n=10）Tab.3 Comparison of serum IL-2 and TNF-α levels in each group（±s，pg/mL，n=10）

注：與A組比較，#P ＜0.01。Note：Compared with those in group A，#P ＜0.01.

組別A組B組C組D1組D2組D3組劑量（g/kg）0.02 100 80 40 IL-2 208.54±24.55 132.37±20.16#116.72±22.34 177.53±21.68*140.61±20.04 145.28±21.36 TNF-α 101.33±12.55 79.25±5.81#103.57±6.74**118.05±10.26**109.23±11.17**88.46±9.25

3 討論

本研究中計算出LD50，為后續制劑研制劑量的設置提供了依據，其長期毒性還需進一步考察。抗腫瘤活性研究中，花椒根總生物堿高劑量組荷瘤小鼠瘤體質量顯著減輕，結合HE 及Tunel 染色結果可見，花椒根總生物堿對H22移植瘤的生長有一定抑制作用。

IL-2 是由輔助性T 細胞1（Th1）分泌產生的參與免疫應答的重要細胞因子，對T 細胞和自然殺傷細胞的增殖、活化具有良好的促進作用［10］；TNF-α 可促使腫瘤細胞的溶酶體破裂，釋放出水解酶而使腫瘤細胞溶解，同時可參與IL-6，IL-8 等細胞因子的激活而誘導腫瘤細胞凋亡［11］。本研究結果顯示，花椒根總生物堿高劑量組小鼠血清IL-2 水平明顯升高，花椒根總生物堿高、中劑量組小鼠血清TNF-α 水平均明顯，升高，說明花椒根總生物堿可能通過調節血清中IL-2和TNF-α 水平來增強機體的免疫應答能力，促進其抗腫瘤活性。

腫瘤細胞增殖與凋亡失衡決定了腫瘤的生長速率。細胞凋亡即細胞程序性死亡，誘導腫瘤細胞凋亡是當前抗腫瘤藥研發的重要策略之一［12］。本研究中花椒根總生物堿干預后細胞凋亡率明顯升高，表明花椒根總生物堿具有促進腫瘤細胞凋亡的作用，其激活凋亡途徑而最終促進細胞凋亡的機制尚待進一步研究。

綜上所述，花椒根總生物堿具有體內抗腫瘤作用，其機制可能與增強機體細胞免疫功能及促進腫瘤細胞凋亡有關。