清利塞鼻洗液處方藥材中有效成分提取工藝研究*

藍 偉，胡玉良，曾聰彥

（廣州中醫藥大學附屬中山中醫院，廣東 中山528400）

清利塞鼻洗液源于中山市中醫院經驗方，由辛夷、白芷、廣藿香、魚腥草等9味中藥材組方，可用于鼻內鏡術后的鼻腔沖洗，能促進鼻腔、鼻竇黏膜形態和功能的恢復。目前，清利塞鼻洗液的提取工藝為水煎煮提取，而魚腥草、廣藿香和薄荷藥材的揮發油含量高，有效成分易損失，故有必要對其現有提取工藝進行改良。辛夷和白芷具有祛風散寒、宣肺通竅之功效，其提取物木蘭脂素和歐前胡素的含量將直接影響制劑的質量和療效。本研究中采用水蒸氣蒸餾法提取揮發油，藥渣再與其余藥味進行水提取［1］，并對主要工藝參數進行正交優選，篩選出最佳提取工藝。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 型高效液相色譜儀（安捷倫科技＜中國＞有限公司）；BS224S型電子天平（賽多利斯斯泰迪＜北京＞有限公司，精度為0.1 mg）；HWS-12型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司）；東方A型電熱恒溫干燥箱、揮發油提取裝置（廣州東方電熱干燥設備有限公司）；HX64268446 型薄層普通調溫電熱套層析硅膠板（上海默克化工技術有限公司，規格為10 cm×20 cm）；YH型調溫電熱套（江蘇建湖縣近湖鎮教學儀器廠）。

1.2 試藥

木蘭脂素對照品（批號為110882-201909，含量≥95%），歐前胡素對照品（批號為110826 - 201918，含量≥98%），廣藿香對照藥材（批號為121135-200503），魚腥草對照藥材（批號為121046 - 200904），薄荷對照藥材（批號為120916 - 201109），均購自中國食品藥品檢定研究院；其余試劑均為分析純，水為超純水；辛夷、白芷、薄荷等9 味藥材均購自廣州致信藥業股份有限公司，藥材信息見表1。

表1 藥材信息Tab.l Information of medicinal materials

2 方法與結果

2.1 木蘭脂素和歐前胡素含量測定

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Simpsil C8柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～30 min時36%A，45 min時75%A，50 min時80%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：230 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

2.1.2 溶液制備

取木蘭脂素對照品0.024 12 g，精密稱定，加甲醇溶解并定容至25 mL；取歐前胡素對照品0.003 5 g，精密稱定，加甲醇溶解并定容至100 mL；精密吸取上述溶液各5 mL置10 mL容量瓶中，搖勻，制成木蘭脂素、歐前胡素質量濃度分別為482.4，17.5 μg/mL的混合對照品貯備液；精密量取5 mL，加甲醇定容至20 mL，即得木蘭脂素、歐前胡素質量濃度分別為120.6 μg/ mL 和4.375 μg/ mL 的混合對照品溶液。取樣品20 mL，加乙酸乙酯，提取2 次，每次15 mL，合并提取液，蒸干，殘渣加甲醇使溶解，定容至5 mL，充分混勻，經0.45 μm 微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。取除辛夷、白芷以外的藥材樣品，按清利塞鼻洗液制備工藝制成陰性樣品，再按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。

2.1.3 方法學考察

專屬性試驗：取2.1.2 項下3 種溶液各10 μL，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相同位置處有相應吸收峰，且陰性對照無干擾，詳見圖1。

線性關系考察：取2.1.2項下混合對照品貯備液適量，用甲醇稀釋成木蘭脂素質量濃度為30.15，60.30，120.60，241.20，482.40 μg/ mL，歐前胡素質量濃度為1.093 75，2.187 5，4.375，8.75，17.5 μg/mL 的系列混合對照品溶液；精密量取10 μL，按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以各成分的質量濃度為橫坐標（X，μg/mL）、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程，木蘭脂素為Y1= 23.753 76X1- 134.55（R2=0.999 8，n=5），歐前胡素為Y2=53.062 73X2-4.791 67（R2= 0.999 8，n= 6）。結果表明，木蘭脂素和歐前胡素質量濃度分別在30.15～482.4 μg/ mL 和1.093 75～17.5 μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：精密量取2.1.2項下混合對照品溶液10 μL，按2.1.1 項下色譜條件連續進樣測定6 次，記錄峰面積。結果木蘭脂素和歐前胡素峰面積的RSD分別為0.95%和0.97%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取2.1.2 項下供試品溶液適量，室溫下分別于0，5，10，15，24 h 時按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果木蘭脂素和歐前胡素峰面積的RSD分別為0.38%和1.49%（n= 5），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內穩定性良好。

重復性試驗：取同一批樣品，共6 份，各20 mL，按2.1.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結果木蘭脂素和歐前胡素平均含量的RSD分別為1.01%和0.69%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取同一批樣品，共6份，各10 mL，分別精密加入已知含量的混合對照品溶液1 mL，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，再按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算回收率。結果見表2。

表2 加樣回收試驗結果（n=6）Tab.2 Results of the recovery test（n=6）

2.2 揮發油提取工藝優化

正交試驗：揮發油提取以加水量（因素A）、浸泡時間（因素B）、提取時間（因素C）為考察因素，以揮發油量為評價指標進行L9（34）正交試驗［2-7］。結果見表3 至表5。由表4 可見，提取時間是出油量的主要影響因素，最佳工藝可初步確定為A2B3C2或A3B3C2。由表5可見，三因素對提取結果均無顯著影響，故根據揮發油量采取加10 倍量水、浸泡60 min、提取3 h 的方案，此時的出油量較高，加水量對出油量影響不大，故揮發油最佳提取方案為A2B3C2。

表3 揮發油提取工藝優化因素水平Tab.3 Factors and levels of extraction process of volatile oil

表4 揮發油提取工藝優化正交試驗設計與結果（n=9）Tab.4 Design and results of orthogonal test for the extraction process of volatile oil（n=9）

表5 揮發油提取工藝優化方差分析結果Tab.5 ANOVA results of the extraction process of volatile oil

1.木蘭脂素 2.歐前胡素A.混合對照品溶液 B.供試品溶液 C.陰性對照品溶液圖1 高效液相色譜圖1.Magnolia 2.AmmidinA.Mixed reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatogram

驗證試驗：取藥材樣品（魚腥草40 g、薄荷20 g、廣藿香20 g），置圓底燒瓶中，并安裝冷凝管和揮發油測定器，持續加熱，按最佳工藝回流提取，收集揮發油［8-9］，平行操作3 次，結果揮發油量分別為0.40，0.40，0.41 mL，平均0.403 mL，RSD為1.43%。

2.3 水提取工藝優化

正交試驗：以加水量（因素A）、浸泡時間（因素B）、提取次數（因素C）和提取時間（因素D）為考察因素，以木蘭脂素、歐前胡素和總固體含量為評價指標進行L9（34）正交試驗［10-13］。結果見表6至表8。由表7和表8可見，因素C和因素D是主要影響因素，其中因素C對總固體含量有顯著影響，因素D對歐前胡素含量有顯著影響。綜合各方面因素進行分析，最終確定水提取工藝為A2B2C3D1。

表6 水提取工藝優化因素水平Tab.6 Factors and levels of water extraction process

表7 水提取工藝正交試驗設計與結果（n=9）Tab.7 Design and results of orthogonal test for the water extrac?tion process（n=9）

表8 水提取工藝優化方差分析結果Tab.8 ANOVA results of the water extraction process

驗證試驗：取除魚腥草、薄荷、廣藿香以外的藥材樣品，加入揮發油提取后剩余的藥渣，收集煎煮液，濾過，濃縮至清膏，加入羥苯乙酯和苯甲酸鈉適量，混勻，按最佳水提工藝，加水至規定量，即得水提樣品，并進行含量檢測，平行操作3次。結果見表9。

表9 水提取工藝優化驗證試驗結果Tab.9 Results of the validation test for the water extraction process

3 討論

3.1 提取工藝路線設計

本研究中清利塞鼻洗液的制備是在考慮實驗室設備條件、工業生產安全可行性等因素的基礎上，設計合理的提取工藝路線。由于方中魚腥草、廣藿香和薄荷均含揮發油成分，故應綜合考慮揮發油和提取油后藥渣的水溶性成分，采用水蒸氣蒸餾提取法。辛夷、白芷等藥材的有效成分在水中溶解度高，故采用水提取法。

3.2 評價指標選擇

中藥方劑主要依靠其所含多種化學成分和活性分子發揮綜合、協同的治療作用。對提取工藝條件參數的選擇，不僅要考慮主要藥味所含指標成分的有效提取量，而且要兼顧其他藥材的有效成分，僅單個定量指標不易將各味中藥材的有效成分均充分表達，故本研究中的水提取工藝選擇了木蘭脂素、歐前胡素和總固體的含量作為評價指標。木蘭脂素是辛夷的主要有效成分，歐前胡素是白芷的主要有效成分，兩者均為方中主要的水溶性成分，與總固體含量結合評價，就能篩選出較合理的水提取工藝參數。

3.3 正交試驗分析

采用正交試驗優化中藥類洗劑提取工藝時，多以有效成分、總固體的含量檢測優選工藝參數，本試驗中分別篩選出揮發油提取和水提取的最佳條件，經優選工藝提取的洗液質量得到了保證［14-15］。驗證試驗結果表明，水提液中木蘭脂素含量波動較大，可能與藥材質量及取樣不均有關，日后將擴大樣品量進行研究，以期得到更準確的數據。

3.4 薄層色譜分析

為了驗證本課題所設計的提取工藝流程是否合理可行，對產品質量是否有提高作用，對采用新舊工藝所得樣品進行薄層色譜對照。結果表明，采用新工藝所得樣品，保留了更多揮發油成分，大幅提高了產品質量。