柴胡-白芍藥對治療2 型糖尿病的網絡藥理學作用機制研究

黃錦珠，殷 貝，畢藝鳴，范冠杰△

（1.廣州中醫藥大學第二臨床醫學院，廣東 廣州 510120； 2.廣東省中醫院內分泌科，廣東 廣州 510006）

《中國居民營養與慢性病狀況報告（2015）》顯示，我國成年人糖尿病的患病率為9.7%，60歲以上人群有所提高（近20%）［1］，預計到2045年，患者數將達1.198億例［2］。對柴胡-白芍藥對治療2型糖尿病（T2DM）臨床有效性的認知主要源于臨床經驗［3］，目前仍缺乏藥理學研究解釋其活性成分的作用機制。網絡藥理學以系統生物學理論為發展源頭，通過選取特定信號節點進行多靶點藥物分子設計，體現了多靶點、多途徑、多通路對生物效應的調節作用，有助于確認作用通路［4］及藥物之間的相互作用［5］，現廣泛運用于預測和辨識中藥作用靶點及活性成分群，闡明作用機制，科學解釋組方規律，發現新的適應證及活性化合物，與組學技術結合應用等多個方面［6］。本研究中擬對柴胡- 白芍藥對的主要活性成分及T2DM 患者的基因進行篩選，建立藥物-疾病關系網絡，探討柴胡-白芍藥對與T2DM 的潛在關系。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 柴胡、白芍活性成分及靶點的挖掘與篩選

以中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）作為數據來源，將口服生物利用度（OB）和類藥性（DL）作為參數，設OB ＞30%，DL ＞0.18，篩選并獲得柴胡、白芍相關活性成分及對應靶點。

1.2 T2DM 相關基因獲取

以“Diabetes Mellitus”為 關 鍵 詞，在GeneCards（https：//www.genecards.org/）和NCBI 數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中進行人類基因檢索，剔除重復數據，統計出唯一基因。

1.3 藥物-疾病核心靶點獲取

將得到的柴胡- 白芍藥對預測靶點與T2DM 的人類基因靶點取交集，即得柴胡-白芍藥對作用于T2DM的預測靶點。利用Venny 2.1 軟件，構建活性成分- 疾病作用靶點網絡圖，得到共有靶點，作為藥物作用于疾病的預測靶點，進行京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。

1.4 潛在靶點蛋白-蛋白相互作用分析

將篩選得到的柴胡- 白芍藥對治療T2DM 的預測靶點上傳到String數據庫（http：//cn.string-db.org/），選擇“Homo Sapiens”，進行蛋白間相互作用分析，得到蛋白互作（PPI）網絡，通過R 軟件繪制PPI 網絡關鍵靶點柱狀圖。將PPI 網絡導入Cystoscape 3.6.0 中，通過Network Analyzer 軟件進行拓撲分析，以介度、緊密度、度中心值、平均最短路徑長度4 個參數為參考標準，通過“度中心值”排序，選取分值大于平均分的基因作為關鍵靶點。

1.5 MCODE 聚類分析

借助MCODE 網絡分析工具的分析功能，選擇關鍵基因。將PPI 網絡導入Cytoscape 3.6.0 中，打開MCODE模塊進行基因簇分析及核心基因篩選。

1.6 信號通路分析

通過String數據庫對柴胡-白芍藥對治療T2DM的潛在靶點進行基因本體論（GO）功能富集分析和KEGG通路富集分析。將藥物、疾病的共有靶點進行GO 的生物過程（BP）、分子功能（MF）、細胞組分（CC）富集分析，篩選校正P值≤0.05的項目，KEGG 通路富集分析同。預測柴胡-白芍藥對治療T2DM的潛在作用機制。

2 結果

2.1 活性成分

共收集到柴胡的化學成分349個，白芍的化學成分85個。同時滿足OB和DL的柴胡活性成分17個，白芍活性成分13 個。剔除無靶點及重復活性成分10 個，共獲得20個活性成分。詳見表1。

表1 柴胡-白芍藥對主要活性成分Tab.1 Main active ingredients of Bupleuri Radix-Paeoniae Alba Radix drug pairs

2.2 藥物-疾病靶點

查找柴胡-白芍藥對的20種有效活性成分對應的潛在靶點，剔除無效及重復靶點后，共得到185 個潛在靶點。經GeneCards 和NCBI 數據庫匯總和剔重，共得1 669 個T2DM 靶點蛋白。將上述兩類靶點進行交集處理，得104 個靶點，即為柴胡- 白芍藥對治療T2DM 的潛在靶點。詳見圖1。

圖1 柴胡-白芍藥對治療2型糖尿病的藥物-疾病靶點Fig.1 Drug-disease target of Bupleuri Radix-Paeoniae Alba Radix drug pairs for the treatment of T2DM

2.3 PPI 網絡構建及拓撲分析

共篩選出45 個關鍵靶點，其PPI 網絡圖見圖2。前20個靶點的柱狀圖見圖3。PPI網絡分析結果顯示，平均節點度為31.4，節點度值排名前10 位的靶點為IL-6，AKT1，VEGFA，CASP3，IL - 1β，MAPK8，MMP9，JUN，PTGS2，CXCL8，這些靶點可能是柴胡- 白芍藥對治療T2DM的關鍵靶點。

圖2 柴胡-白芍藥對治療2型糖尿病靶點的PPI網絡圖Fig.2 PPI network of Bupleuri Radix-Paeoniae Alba Radix drug pairs for the treatment of T2DM

圖3 PPI網絡關鍵靶點柱狀圖Fig.3 Histogram of key targets of PPI network

2.4 聚類分析

柴胡-白芍藥對治療T2DM靶點的核心基因見表2。共得到5 個基因簇和5 個核心基因，核心基因為GSK3B，NFKBIA，CAV1，VCAM1，SLC6A2。詳見圖4。

圖4 柴胡-白芍藥對治療2型糖尿病的5個基因簇和5個核心基因Fig.4 Five gene clusters and five core genes of Bupleuri Radix-Paeoniae Alba Radix drug pairs for the treatment of T2DM

表2 柴胡-白芍藥對治療2型糖尿病靶點的核心基因Tab.2 Core gene of Bupleuri Radix-Paeoniae Alba Radix drug pairs for the treatment of T2DM

2.5 功能GO 富集分析

共 富 集 到2 055 條BP，136 項MF，47 項CC。詳見圖5。

圖5 柴胡-白芍藥對治療2型糖尿病關鍵靶點GO功能富集分析結果Fig.5 GO functional enrichment analysis results of Bupleuri Radix-Paeoniae Alba Radix drug pairs for the treatment of T2DM

2.6 KEGG 通路富集分析

共富集到157條信號通路。詳見圖6。

圖6 柴胡-白芍藥對治療2型糖尿病KEGG通路富集分析結果Fig.6 KEGG pathway enrichment analysis results of Bupleuri Radix-Paeoniae Alba Radix drug pairs for the treatment of T2DM

2.7 中藥-活性成分-疾病靶點網絡構建

中藥-活性成分-疾病-靶點PPI 網絡見圖7（網絡中黃色為藥物作用于疾病的靶點，藍色為化合物，紅色為疾病糖尿病，紫色為白芍、柴胡）。將活性成分篩選出來按程度值排列（值越大成分越重要），排前5位的依次是Quercetin（MOL000098）、Kaempferol（MOL000422）、Isorhamnetin（MOL000354）、β-Sitosterol（MOL000358）、Stigmasterol（MOL000449），每種均能與多個靶點相互作用。詳見表3。

表3 活性成分信息Tab.3 Information of active ingredients

圖7 柴胡-白芍藥對活性成分與交集靶點相互作用網絡圖Fig.7 Interaction network of active ingredients and intersection targets of Bupleuri Radix -Paeoniae Alba Radix drug pairs

3 討論

在我國，糖尿病已成為繼腫瘤、心血管疾病后第三大嚴重影響患者身心健康的疾病［7］，中醫以高療效和少副作用的優勢，在T2DM 的診治中發揮著重要作用。肝氣郁滯證因生活壓力增大而越來越常見，肝郁日久會造成心理慢性應激、海馬損傷，導致下丘腦-垂體-腎上腺軸功能亢進，促使促腎上腺皮質激素和糖皮質激素釋放增加，血濃度升高，這些激素均有拮抗胰島素功能的作用，還能引起胰島B 細胞功能紊亂、脂肪因子分泌和微血管功能發生異常，從而導致胰島素抵抗、血糖升高，最終導致T2DM 的發生［8］。故疏肝解郁法治療T2DM得到臨床認可，其中柴胡-白芍是常見藥對。

柴胡- 白芍藥對的主要活性成分可能為槲皮素、山柰酚、異鼠李素。槲皮素具有抗氧化、抗炎、降血糖、調血脂、降血壓及免疫調節作用［9］。山柰酚可改善胰島素抵抗和保護胰島B細胞，還可通過抑制炎性反應和氧化應激減輕高血糖所致心臟損傷，降低心血管事件發生率［10］。異鼠李素通過激活骨骼肌細胞中JAK 2/STAT通路介導葡萄糖轉運蛋白4易位來促進葡萄糖攝取，因此可能通過在生理濃度下預防高血糖而具有維持葡萄糖穩態的作用［11］。本研究中篩選出柴胡-白芍藥對治療T2DM 的靶點104 個，進一步佐證了中藥治療疾病具有多成分、多靶點協同作用的特點。

通過分析PPI 網絡圖發現，柴胡- 白芍藥對與T2DM 關系密切，各靶點間有許多生物學聯系，如蛋白質 水 平 的IL - 6，AKT1，VEGFA，CASP3，IL - 1β，MAPK8，MMP9，JUN，PTGS2，CXCL8 等。其中，IL - 6，IL- 1β，CXCL8 均為炎性因子。炎性反應是T2DM 重要的發病機制之一，其可能與導致胰島素抵抗和胰島B細胞損傷有關。VEGF 是作用于內皮細胞的促血管生長因子，據報道，VEGFA mRNA 可能改善血管病變，從而通過延緩糖尿病進程［12］。MAPK 屬促分裂原活化蛋白激酶，通過降低其表達水平可減輕炎性反應，維持胰島素的正常分泌，進而促進葡萄糖吸收。MMP9 主要參與了血管的再生及炎性反應等過程，其可破壞細胞組織、產生炎性反應而發揮促炎作用，且MMP9水平與其出現微血管病變及程度呈正相關［13］。本研究結果表明，柴胡-白芍藥對可能通過減輕炎性反應，從而對T2DM 起到治療作用，通過修復血管損傷而控制糖尿病及相關并發癥的發生、發展。

KEGG 通路富集顯示，AGE - RAGE 信號通路、流體剪切力及動脈硬化、IL - 17 信號通路、TNF 信號通路、乙型肝炎等是柴胡- 白芍藥對發揮降糖作用的主要通路。T2DM及其并發癥發生的重要原因之一是AGERAGE 下游信號轉導通路的激活，導致大量促炎因子、促纖維因子釋放，進而造成相應組織器官的損傷［14］。另外，FRANCISCO 等［15］研究發現，T2DM 患者外周血中CD3+T 淋巴細胞可產生大量IL-17 蛋白，而經過積極治療的患者的血糖及IL - 17 水平均明顯下降，說明IL- 17 信號通路可能在T2DM 發病過程中發揮重要作用。通過TNF 信號通路介導的炎性反應除了可引起胰島素抵抗外，還可導致胰島B 細胞損傷，最終導致胰島功能衰竭。由GO 功能富集分析結果可見，以炎性因子升高為特征的慢性低度炎癥與代謝異常密切相關，最終可引起T2DM 的發生、發展。而MCODE聚類分析結果提示，GSK3B，NFKBIA，CAV1，VCAM1，SLC6A2為柴胡-白芍藥對治療T2DM 的核心基因，均已被證明［16-18］可通過炎癥通路導致糖代謝異常，進而影響血管病變，導致糖尿病足、糖尿病周圍神經病變、糖尿病視網膜病變等的發生［19-20］，與PPI 網絡中提示通過化合物干預炎性反應而控制糖尿病的結果相互佐證。

綜上所述，柴胡- 白芍藥對治療T2DM 具有多靶點、多通路、多生物學成分發揮作用的治療特點，其可能是通過影響炎性反應、改善血管病變等途徑發揮降糖及延緩糖尿病進程的作用，但挖掘得到的信號通路間的生物關系和作用機制仍需大量試驗數據支持。