PI3KCA在子宮內膜癌中的表達及與臨床病理特征的關系

馬瑩，張哲，曲章義，韓旭

(1.哈爾濱醫科大學附屬第一醫院婦科腔鏡科，哈爾濱 150001； 2.哈爾濱醫科大學公共衛生學院衛生微生物學教研室，哈爾濱 150001)

子宮內膜癌(endometrial carcinoma，EC)是一種常見婦科腫瘤，在多數歐美發達國家EC患者占婦科腫瘤總數的50%[1]。我國每年新診斷EC患者高達20萬，因EC死亡患者數量亦逐年升高[2-3]。近年來的研究表明，磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白通路是一種與多種惡性腫瘤發生、發展及不良預后相關的信號轉導通路，目前在非小細胞肺癌[4]、卵巢癌[5]、骨肉瘤[6]等中研究較多，主要通過影響細胞增殖、凋亡、侵襲、遷移以及促血管生成發揮相應作用[7]。PI3K在哺乳動物中可分為PI3KⅠ型、PI3KⅡ型、PI3KⅢ型3個亞型，其中PI3KⅠ型與腫瘤的關系最為密切，而PI3KCA主要編碼PI3KⅠ型中參與惡性腫瘤發生發展的關鍵催化亞基p110α[8]。本研究旨在通過研究PI3KCA在EC組織中的表達情況及其與臨床病理特征的關系，為判斷EC患者病情嚴重程度以及預后提供幫助，并為EC的分子治療奠定基礎。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2017年9月至2019年9月在哈爾濱醫科大學附屬第一醫院婦科住院治療的83例EC患者作為EC組，選取同期83例子宮肌瘤患者作為子宮肌瘤組。納入標準：①EC組經病理學檢查確診[9]；②手術前未經過放化療、免疫治療及內分泌治療。排除標準：①轉移性EC；②合并其他惡性腫瘤；③長期使用糖皮質激素。EC組年齡37～70歲，平均(57±6)歲；淋巴轉移情況：陽性33例、陰性50例；病理分級：低分化27例、中分化29例、高分化27例；肌層浸潤深度：≥1/2 70例，<1/2 13例；國際婦產科聯盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO)分期：Ⅰ期23例、Ⅱ期25例、Ⅲ期22例、Ⅳ期13例。子宮肌瘤組年齡40～69歲，平均(56±6)歲。兩組年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)。本研究經哈爾濱醫科大學附屬第一醫院倫理委員會批準，患者均簽署了知情同意書。

1.2方法

1.2.1反轉錄實時聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)檢測 ①采用TRIzol法(Invitrogen?)提取標本的總RNA，采用Invitrogen?Qubit 4熒光計檢測提取總RNA的濃度及純度，檢測合格后繼續下游實驗。②按照BcaBEST?RNA PCR Kit Ver.1.1說明，將總RNA反轉錄為互補DNA，反應條件：65 ℃ 1 min，30 ℃ 5 min，65 ℃ 30 min，98 ℃ 5 min，5 ℃ 5 min。③按照Bimake?2x SYBR Green反轉錄PCR master mix說明，以互補DNA為模板進行PCR擴增。甘油醛-3-磷酸脫氫酶及其引物均包含在試劑盒內。PI3KCA基因特異性引物由吉林庫美生物科技有限公司合成，上游引物：5′-CTCTGAGGAGGTGGGTAG-3′，下游引物：3′-CGGTGGTCAGTTGAGTAA-5′。反應體系共25 μl：互補DNA模板4 μl，上下游引物各 1.25 μl，2x SYBR Green反轉錄PCR master mix 12.5 μl，雙蒸水6 μl。使用美國Thermofisher ABI QuantStudio 1熒光定量PCR儀，反應條件：94 ℃ 30 s、54 ℃ 30 s、72 ℃ 2 min，以上40個循環，72 ℃ 5 min總延伸。④每個標本重復3次實驗，記錄Ct值，并取平均值，平均Ct值≤20為PI3KCA基因高表達，平均Ct值>20為PI3KCA基因低表達。另采用ΔΔCt法進行相對定量分析，根據Ct平均值以2-ΔΔCt表示PI3KCA基因的相對表達量。

1.2.2免疫組織化學檢測 ①將石蠟包埋的標本切片，厚度4 μm，每個標本切5片。1片空白對照，1片蘇木精-伊紅染色，3片行免疫組織化學檢測。②免疫組織化學按照SP法試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，批號：SP0021)說明進行操作，石蠟切片經脫蠟、梯度乙醇水化、3%過氧化氫去除內源性過氧化物酶后，再用微波法進行抗原修復。利用山羊血清對石蠟切片封閉，然后滴加兔源PI3KCA相關蛋白(p110α)抗體(美國Affinity Biosciences公司生產，1∶5 000稀釋)，過夜孵育后滴加Bio-羊抗兔IgG(1∶100稀釋)及鏈霉親和素-過氧化物酶(1∶100稀釋)，二氨基聯苯胺顯色。③用Mayer′蘇木精染色劑復染，脫水，封片。④用顯微鏡觀察染色物質及其出現的位置及染色深度。無染色顆粒為PI3KCA相關蛋白不表達，淺黃色顆粒為PI3KCA相關蛋白低表達，棕黃色顆粒為PI3KCA相關蛋白中表達，褐色顆粒為PI3KCA相關蛋白高表達[10]。

2 結 果

2.1兩組子宮內膜組織PI3KCA基因表達量比較 EC組子宮內膜組織PI3KCA基因表達量明顯高于子宮肌瘤組[(1.24±0.24)比(0.26±0.11)](t=33.417，P<0.001)。

2.2EC組織中PI3KCA基因表達與臨床病理學特征的關系 EC組織標本中，PI3KCA基因高表達率為51.8%(43/83)，PI3KCA基因低表達率為48.2%(40/83)。不同淋巴轉移情況、肌層浸潤深度及FIGO分期的PI3KCA基因高表達率比較差異有統計學意義(P<0.05)；不同病理分級的PI3KCA基因高表達率比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 EC組織中PI3KCA基因表達與臨床病理特征的關系 [例(%)]

2.3兩組PI3KCA相關蛋白表達陽性率比較 PI3KCA相關蛋白在EC細胞中主要表達于細胞質及細胞膜，見圖1。EC組PI3KCA相關蛋白表達陽性率明顯高于子宮肌瘤組[100.0%(83/83)比33.7%(28/83)](χ2=82.250，P<0.001)。

注：EC為子宮內膜癌圖1 子宮內膜中PI3KCA相關蛋白(p110α)的表達 (Mayer′蘇木精染色)

2.4EC組織中PI3KCA相關蛋白表達情況與臨床病理特征關系 在EC患者子宮內膜組織標本中，PI3KCA相關蛋白高表達率為32.5%(27/83)、中表達率為25.3%(21/83)、低表達率為42.2%(35/83)。不同淋巴轉移情況、肌層浸潤深度及FIGO 分期的PI3KCA相關蛋白表達情況比較差異有統計學意義(P<0.05)，不同病理分級的PI3KCA相關蛋白表達情況比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 EC組織中PI3KCA相關蛋白表達情況與臨床病理特征的關系 [例(%)]

3 討 論

絕經后女性是EC的主要發病人群，但近年20～44歲EC患者的比例逐漸升高，約7%[11]。EC發病率的升高及患病群體的年輕化迫切要求對EC病情進行精準判斷，制訂個體化的治療方案[12]。因此，本研究從PI3K/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號轉導通路中編碼PI3K的PI3KCA基因入手，觀察PI3KCA在不同病情嚴重程度EC患者中表達量的差異，以期準確判斷患者病情，從而延長患者生存期，改善預后。

PI3K/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號轉導通路在調控腫瘤細胞增生、細胞周期、細胞程序性死亡等方面發揮作用，其在多種惡性腫瘤中異常表達[13]。PI3KCA基因作為PI3K/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號轉導通路上游位點的重要調控基因之一，能夠促進細胞產生惡性行為，PI3KCA基因主要通過其編碼表達的催化亞基p110α蛋白發揮作用，p110α蛋白具有類脂激酶及蛋白激酶雙活性[14-15]，PI3KCA基因突變導致p110α蛋白過表達，進而導致下游激酶活性增加，PI3K/蛋白激酶B通路持續激活，最終產生癌變[16]。Denninghoff等[17]研究發現，PI3KCA是較常見的可發生突變的癌基因，因此目前對EC發生發展中PI3KCA基因重要作用的研究具有理論意義。

本研究結果顯示，EC病情嚴重程度與PI3KCA表達量高度相關，在RNA以及蛋白質層面，PI3KCA基因及其編碼表達的p110α蛋白的表達量隨EC淋巴結轉移范圍擴大、肌層浸潤深度增加、FIGO分期及病理分級升高而升高，表明PI3KCA基因在EC的發生發展過程中發揮重要作用。目前，對PI3KCA基因在人類惡性腫瘤發生發展中作用的研究逐漸增多，以膽管癌、肺癌及乳腺癌等為主[18]，對EC的相關研究有限。本研究中，未發現PI3KCA基因表達量與EC臨床病理分級之間的明顯相關性，但并不說明兩者完全沒有關聯，其原因可能與本研究納入樣本量有限、病理類型主要為子宮內膜樣腺癌有關，尚不能排除不同病理類型導致研究結果的差異，需要進一步探索。

隨著分子生物學的發展，對于腫瘤研究的重點逐漸傾向于分子靶向治療，準確找到有效的分子靶點，針對靶點精準用藥可提高治療效果。本研究結果顯示，PI3KCA表達量與EC患者病情的嚴重程度相關，因此針對該基因位點進行靶向治療，可能在很大程度上改善患者的預后。研究發現，順鉑可能通過抑制PI3K通路誘導EC細胞發生自噬[19]，而PI3KCA是PI3K通路重要的上游基因。同時，PI3KCA可通過磷酸化BAD蛋白及胱天蛋白酶9阻止細胞凋亡[20]，抑制糖原合成酶激酶-3β的活性，從而阻止G1/S-特異性周期蛋白D1的降解，促進腫瘤G1/S細胞周期的轉化[21]，上述研究結果在細胞自噬、凋亡以及細胞周期調控方面均為EC患者的治療提供了新的分子生物學思路。曹海敬等[22]證明，PI3KCA基因突變可使下游通路活化，進而抑制細胞程序性死亡，使細胞無限繁殖產生癌變，因此針對PI3KCA基因的抑制劑研究具有重要臨床意義。目前，許多P13KCA基因抑制劑進入臨床試驗階段[23]，但標準化的用藥方案及治療效果尚不確切，且人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因突變患者的PI3KCA基因突變率較高[24]，因此PI3KCA抑制劑與多種藥物聯合治療腫瘤可能成為未來的研究方向。目前，中國科學院開發的PI3Kα抑制劑已獲得美國食品藥品管理局的臨床試驗許可，計劃用于實體腫瘤的晚期治療[25]，這為EC的治療提供了可行性。本研究利用相應的試驗室技術分別在蛋白質和RNA層面證明了PI3KCA參與EC的發生發展過程，驗證了PI3KCA與EC臨床病理特征的關系，說明PI3KCA是一種具有潛在治療價值的靶向位點，但尚有許多問題需進一步探索。

綜上所述，EC組織PI3KCA表達量高于正常子宮內膜組織，且PI3KCA表達與EC的臨床病理學特征有一定的相關性。