氯膦酸二鈉脂質體治療小鼠膝骨關節炎的作用機制

曾陽 陸鋒藝 莊汝杰

膝關節骨性關節炎（KOA）是臨床中常見的關節退行性疾病，以慢性關節疼痛及活動受限為主要臨床特點，好發于中老年人群，是中老年人致殘的主要因素之一［1］?，F階段國內外對KOA的研究主要集中在炎癥反應方面，各種炎性因子的釋放導致膝關節中積液增多，刺激滑膜組織增生，軟骨破壞［2-3］，其中MMP-13等一系列基質金屬蛋白酶被認為在軟骨破壞中起主要作用［4］，且膝骨關節炎患者中IL-6水平顯著增高［5］。有研究表明［6］，氯膦酸二鈉脂質體對巨噬細胞具有耗竭作用，而巨噬細胞能釋放包括IL-6在內的多種炎癥介質。本文探討氯膦酸二鈉脂質體對小鼠膝骨關節炎（KOA）的治療作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑 8周齡健康雄性C57BL/6小鼠（購自浙江中醫藥大學動物實驗中心），氯膦酸二鈉脂質體（LIPOSOMA），RNA 純化試劑盒（Invitrogen），RNase-Free DNA 清除試劑盒（Qiagen）、SuperScript? III逆轉錄酶預混液（Invitrogen）、SYBR?Green PCR預混液、高速冷凍離心機（Sigma），紫外分光光度計（Beckman）、CFX384多重實時熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad）等。

1.2 動物實驗方法 將30只SPF級8周齡健康雄性C57BL/6小鼠，以隨機數字表法分為對照組、空白組、治療組，每組各10只，對照組、治療組小鼠均進行DMM造模法建立小鼠KOA模型，空白組不造模。造模步驟參考WELCH等［7］方法，手術后第4周關節炎造模成功。治療組小鼠在造模成功前1周注射氯膦酸二鈉脂質體（1 mg/mL）1次，進行巨噬細胞耗竭，第4周后繼續注射氯膦酸二鈉脂質體，1次/周；對照組小鼠及空白組小鼠同步注射0.9%氯化鈉溶液20 μL，1次/周。

1.3 檢測方法 （1）總RNA提?。喝悠?，關節處碾磨碎，根據說明書使用TRIzol? Reagent提取RNA。紫外分光光度計和電泳測定其含量、純度及質量，然后貯存在-80℃備用。（2）逆轉錄實驗：加入RNase-Free Water補充至 20 μL，反應條件：25℃，10 min；50 ℃，30 min；85℃，5 min，貯存在 -20℃備用（見表 1）。（3）Real-Time PCR檢測：采用Primer Premier 6.0和Beacon designer 7.8軟件進行定量PCR引物設計，然后由生工生物工程（上海）股份有限公司負責合成，引物序列見表2。反應條件為95℃，1 min；40個循環（95℃，15 s，63℃，25 s，收集熒光），繪制熔點曲線。進行Real-Time PCR基因表達差異分析，每個樣品重復3次，各個基因的相對表達水平以2-ΔΔCt進行統計分析。

表1 1st-Strand cDNA Synthesis反應體系及條件

表2 Real-Time PCR 引物和條件

1.4 統計學方法 采用 SPSS 19.0 統計軟件。計量資料以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

在4周和8周時，空白組和治療組中IL-6、MMP-13表達水平均低于對照組（P＜0.05）；治療組與空白組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），治療組4周與8周IL-6、MMP-13表達水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表 3。

表3 各組不同時點IL-6、MMP-13表達水平比較［pg/mL，（）］

表3 各組不同時點IL-6、MMP-13表達水平比較［pg/mL，（）］

注：與4周對照組比較，*P＜0.05；與8周對照組比較，△P＜0.05

組別 IL-6 MMP-13對照組 4周 211.63±79.33 94.33±6.07 8 周 233.77±44.89 102.54±29.06空白組 4周 39.05±6.23* 20.71±2.81*8周 56.25±13.63△ 12.55±1.07△治療組 4周 53.44±15.09* 32.03±4.95*8周 26.92±2.97△ 17.24±1.83△

3 討論

早期KOA的主要病理表現為軟骨破壞分解與自發的軟骨修復，在這個過程中，由軟骨細胞、巨噬細胞、成纖維細胞等分泌的一些細胞因子被釋放進入血液和關節液中，其中IL-6是參與KOA發病過程中重要的細胞因子，與滑膜炎性病變、關節軟骨基質降解及干擾軟骨細胞功能密切相關［8］。IL-6由軟骨細胞和滑膜成纖維細胞分泌并交叉調節介導，可誘導IL-1增加MMP的合成，抑制蛋白多糖產生［9］，而MMP-13由于其對切割II型膠原的特異性而在軟骨重塑和降解中具有關鍵的限速功能，可通過多種方式和多條通路調節骨骼發育和骨重建［4］。在實驗性OA早期，培養的不同類型的關節炎滑膜細胞均可見IL-6 mRNA表達，關節液中亦可檢測出IL-6活性物質，KOA患者關節液和血清中IL-6含量均高于正常人［10-11］。

氯膦酸二鈉脂質體是一種人工合成的雙膦酸脂，在臨床中多用于骨質疏松的治療［12］。當氯膦酸二鈉脂質體在膝關節腔內被巨噬細胞吞噬，被釋放出的氯膦酸二鈉在巨噬細胞內聚集，當積累到一定程度后，巨噬細胞逐漸失去活性［13］。

本試驗結果顯示，造模組在4周和8周的IL-6、MMP-13表達水平均高于空白組，這進一步驗證IL-6、MMP-13參與膝骨關節炎的發展過程；治療組4周與8周組內比較，兩組IL-6、MMP-13表達水平差異無統計學意義，這表明氯磷酸二鈉脂質體能有效降低膝骨關節炎模型中IL-6、MMP-13表達水平，并表現出持久的作用。MMP-13在空白組中表達較低，在造模組中隨造模時間延長，其表達水平升高，這可能與本模型中滑膜炎表現隨造模時間延長持續加重有關，這與YOSHIHARA［9］等研究結果相一致。本課題前期實驗表明，氯膦酸二鈉脂質體對關節軟骨具有保護作用，能有效降低關節表面破壞，保留較多的健康完整的軟骨細胞；且在細胞模型驗證其對巨噬細胞的耗竭作用。本實驗進一步驗證氯膦酸二鈉脂質體能有效降低膝骨關節炎模型中IL-6、MMP-13表達水平，并將其維持在較低水平。