小麥Ta-miR154的特征及滲透脅迫響應

王苗苗，袁曉波，李 靜，王曉騰，張 莉，李永春

(河南農業大學農學院/省部共建小麥玉米作物學國家重點實驗室，河南鄭州 450046)

干旱、高鹽等滲透脅迫是限制小麥高產穩產的主要逆境因子，探討小麥滲透脅迫響應的生理和分子機制對于開展小麥抗逆分子育種具有重要意義。近年來大量研究表明，microRNAs(miRNAs)作為一類非編碼小RNA(長度在21～24 nt之間)，參與植物生長發育調控、逆境脅迫響應等多個生理調節過程，有關miRNA參與的逆境脅迫響應調控機制已成為植物抗逆分子機理研究的重要領域，特別是miRNA作為抗逆分子育種的重要靶標也日益受到重視。對模式植物擬南芥的研究發現，miR169參與干旱響應的分子調節過程，過表達轉基因材料的耐鹽能力顯著提高。說明miRNA在植物的非生物脅迫應答中具有重要的調控作用。對其他作物研究發現，miR172和miR396與馬鈴薯的脯氨酸合成調控及干旱脅迫響應密切相關，推測這兩個miRNA可能參與了脯氨酸合成過程中關鍵基因的表達調控；過表達轉基因水稻的耐鹽能力降低，推測該miRNA參與了氣孔發育及鹽脅迫響應的調控過程；玉米miR169也與干旱高鹽脅迫調節密切相關。在小麥中，Shi等發現，miR1119參與了抗旱調控過程；Bai等發現，miR408對于耐鹽生理調節至關重要。本課題組前期研究發現，小麥在種子脫水過程中迅速上調表達；在此基礎上，本研究進一步分析了的序列特征及其對干旱和高鹽脅迫的響應模式，以期為探討的功能及其在小麥育種中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設計

試驗所用小麥(L.)品種包括中國春和矮抗58，種植于河南農業大學原陽試驗基地。種子形成過程中，剝取授粉后第5、10、15、20、25和30 d的籽粒，用于分析小麥的特征；取三葉期的根和葉片，開花期的節間、節、穗下節、旗葉，以及成熟期的籽粒，用于組織表達特性分析。脅迫處理過程如下：首先，選取飽滿一致的小麥種子用NaClO(10%)表面消毒；然后，在人工氣候室[溫度為24 ℃(光照)和18 ℃(黑暗)，每天光照16 h，光照強度240 mmol·m·s]水培至兩葉一心期時進行脅迫處理。模擬干旱脅迫采用PEG6000(20%)處理，模擬鹽脅迫采用NaCl溶液(150 mmol·L)處理，分別剪取脅迫處理0、0.5、1、2、6、12、24、48 h的根和葉，用于分析脅迫下的表達量。上述試驗均設3個生物學重復，所有組織用液氮速凍置于-80 ℃保存、備用。

1.2 RNA和DNA的提取

籽?？俁NA采用Trizol Plant試劑盒(全式金，北京)提取，其余組織總RNA采用RNAisoPlus試劑盒(Tarkara，日本)；RNA反轉錄采用TransScript miRNA First-strand cDNA Synthesis Supermix試劑盒(全式金，北京)，合成的cDNA于-80 ℃保存，備用；基因組DNA采用CTAB法提取。

1.3 基因片段的克隆及序列分析

用小麥基因組數據庫Ensembl Plants(http://plants.ensembl.org/Triticum_aestivum/Info/Index)對小麥miR154序列(5′-GGCGAGGGACAUACACUGUACA-3′)進行比對分析，確定基因位點。候選基因序列下載后利用SnapGene軟件進行3個部分同源基因序列比對分析，用RNA Folding Form(http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/rna-folding-form)對RNA的發卡結構進行分析，用Primer 5.0軟件設計引物?？寺〉奶禺惿嫌我餅閅P2093(5′-ATTGTGAACTCCAAGTGGCATG-3′)，下游引物為YP2095(5′-GGTTGTGTTGCTGTGCTCGATC-3′)，用高保真酶LA Taq以基因組DNA為模板進行PCR擴增，PCR擴增體系為20 μL，包括10×LA PCR Buffer Ⅱ 2.0 μL,dNTP mix solution 1.8 μL,TaKaRa LA Taq Enzyme 0.2 μL,Template 1.0 μL,YP2093和YP2095引物(10 μmol·L)各1.0 μL,ddHO 13 μL。PCR擴增程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火1 min 30 s,72 ℃延伸25 s，30個循環；72 ℃延伸10 min， 4 ℃保存?？寺∑芜B接到pMD19-T載體后轉化大腸桿菌DH5α，用載體通用引物YP0085(5′-ATCGGTGCGGGCCTCTT-3′)和YP0086(5′-GGCACCCCAGGCTTTACAC-3′)進行重組克隆，每個品種隨機挑選5個克隆進行測序分析。

1.4 表達模式分析

用RT-qPCR的方法進行實時定量表達分析，反應體系為20 μL，包括cDNA模板1 μL，2×TransStart Tip Green qPCR SuperMix 10 μL，uni prime (10 μmol·L) 0.4 μL，specific prime (10 μmol·L) 0.4 μL，RNase-free水 8.2 μL。其中，uni primer為全式金試劑盒提供的通用引物，specific primer為YP0949(5′-GGCGAGGGACATACACTGTACA-3′)。做熒光定量時，使用試劑盒中的通用引物是由于miRNA的特殊性，miRNA序列很短，miR154成熟序列僅為22 nt，所以在反轉錄時進行了Ploy(A)加尾，在測定的表達量時，上游使用特異引物YP0949(5′-GGCGAGGGACATACACTGTACA-3′)，下游使用通用引物。熒光定量PCR儀型號為Bio-Rad伯樂CFX Connect。每個反應設定3次重復，采用兩步法PCR，反應程序： 94 ℃預變性30 s,94 ℃變性5 s,60 ℃退火30 s，40個循環。內標為snRNA U6，引物為YP1303(5′-CCTTCGGGGACATCCGATAAA-3′)和YP1304(5′- ATTTGGACCATTTCTCGATTTGTGC-3′)。實時定量數據分析采用2-△△法計算，并用Excel 2003作圖。

2 結果與分析

2.1 小麥Ta-miR154的特征分析

用Ensembl Plants對miR154序列進行比對分析，發現基因位于第7同源群染色體上，將其在A、B、D基因組上的3個部分同源基因分別命名為、和。采用特異引物YP2093和YP2095對中國春和矮抗58兩個小麥品種的基因組DNA進行擴增，兩個品種均獲得了約1 000 bp和1 500 bp的兩個片段(圖1A)。將上述兩個片段分別連接到PMD19-T載體，連接產物轉化大腸桿菌后，每個片段隨機挑選5個重組克隆，利用A、B、D基因組特異引物進行鑒定并測序。測序結果顯示，中國春三個部分同源基因、和間的序列存在較大差異。與(993 bp)相比，(1 011 bp)和(1 529 bp)分別存在70(63個SNP和7個InDel)和55(50個SNP和5個InDel)個差異位點；矮抗58和中國春兩個品種間的miRNA前體區域序列高度保守，其中、、和分別存在12、15和5個SNP差異；在生成的莖環結構區域兩個品種間序列完全一致(圖1B)，和分別僅存在1個SNP差異，而與另兩個部分同源基因間存在4個SNP差異，特別是第32位的C/T變異使得其無法生成。RNA發卡結構分析顯示，3個部分同源基因產生的miRNA前體均可形成典型的莖環發夾結構，但由于和間2個單核苷酸的差異導致發夾結構頂端的2個折疊環大小存在一定差異(圖1C)。

A： Ta-MIR154的克隆結果，M: DL2000；1：中國春；2：矮抗58。B： Ta-MIR154三個部分同源基因間的序列比對。C：RNA二級結構分析，紅色圓圈標記區域為成熟miRNA對應區域。A: Cloning results of Ta-MIR154, M: DL2000; 1: Chinese Spring; 2: Aikang 58.B: Sequence alignment among the three homologues of Ta-MIR154 genes.C: Secondary RNA structures of Ta-MIR154 gene,and sequences marked with red circles are regions corresponding to the mature miRNAs.圖1 小麥 Ta-MIR154基因的克隆及序列特征分析Fig.1 Cloning and sequence characterization of Ta-MIR154 gene in wheat

2.2 小麥不同組織中 Ta-MIR154的表達模式 分析

對的組織表達特性進行分析，結果(圖2A)發現，不同組織的表達模式存在明顯差異?？傮w來看，在成熟種子中的表達量最高，其次為節間和根系組織，而在穗下節、節和葉片中的表達量較低；在兩個品種間的表達水平呈現相似的變化趨勢，但矮抗58的表達水平略高于中國春。進一步分析兩品種籽粒發育過程中的表達模式，發現在籽粒發育早期的表達量均較低，而在授粉后20 d表達量迅速上升，授粉后30 d表達量達到最大值。

A: 不同組織中 Ta-MIR154的表達分析；B：籽粒形成過程中 Ta-MIR154的表達分析。RO：根系；IN：節間；PE：穗下節；NO：節；LE：葉；FL：旗葉；MG：成熟籽粒。圖柱上的**表示品種間差異極顯著(P<0.01)。A: Expression of Ta-MIR154 in different wheat tissues;B:Expression of Ta-MIR154 during grain development.RO:Root;IN:Internode; PE: Peduncle;NO:Node;LE:Leaf;FL:Flag leaf;MG:Mature grain.** on the columns indicate significant difference between varieties at 0.01 level.圖2 小麥不同組織中 Ta-MIR154的相對表達量Fig.2 Expression of Ta-MIR154 in different wheat tissues

2.3 干旱脅迫對小麥 Ta-MIR154相對表達量的影響

為探討對干旱脅迫的響應模式，利用qRT-PCR技術分析PEG6000(20%)處理條件下小麥葉片和根系中的表達模式。結果(圖3)顯示，隨著干旱脅迫時間的延長，中國春小麥葉片中的相對表達量總體上呈上升趨勢，特別是脅迫6 h后，上調表達幅度逐漸增加，脅迫24和48 h時的相對表達量分別約為脅迫0 h的6倍和14倍，差異均達極顯著水平；矮抗58葉片中的相對表達量受脅迫誘導后快速上升，且整體上其表達水平要高于中國春(圖3A)，脅迫2、24和48 h的表達量與0 h之間差異均達極顯著水平，推測在葉片中的積累與其抗旱調節能力的增強有關。隨著干旱脅迫時間的延長，中國春根系中的相對表達量呈先上升后下降的變化趨勢，脅迫12 h時的相對表達量最高，約為脅迫0 h的8倍，脅迫12和24 h時的表達量與0 h之間差異均達極顯著水平；而矮抗58根系中的相對表達量呈先降低后上升的變化趨勢，且整體表達水平低于中國春(除脅迫48 h外)(圖3B)，脅迫48 h的表達量與0 h之間差異達極顯著水平。在所檢測的兩個品種間呈現出不同的干旱響應模式，可能與品種的抗旱特性差異有關。

A: 葉片中 Ta-MIR154的表達分析；B：根系中 Ta-MIR154的表達分析。**表示該品種 Ta-MIR154的相對表達量在該脅迫時間與0 h之間差異達極顯著水平(P<0.01)。圖4同。A: Expression of Ta-MIR154 in leaves; B:Expression of Ta-MIR154 in roots.** indicates significant difference of the expression of Ta-MIR154 in the variety between the corresponding stress time and 0 h(P<0.01).The same in figure 4.圖3 干旱脅迫條件下 Ta-MIR154的表達分析Fig.3 Expression of Ta-MIR154 under drought stress

2.4 鹽脅迫對小麥 Ta-MIR154相對表達量的 影響

鹽脅迫條件下，兩個小麥品種間葉片和根系中的表達模式均存在較大差異(圖4A)。隨鹽脅迫時間的延長，中國春葉片中的相對表達量呈先上升后下降的變化趨勢，脅迫24 h時的表達量最高，約為脅迫0 h的17倍，脅迫2～24 h的表達量與0 h之間差異均達極顯著水平；而矮抗58葉片中的相對表達量在各脅迫時間與0 h之間均無顯著差異。中國春根系中的相對表達量在各脅迫時間與0 h之間也均無顯著差異；而矮抗58根系中的相對表達量呈升-降-升的變化趨勢，脅迫2 h時的表達量最高，約為脅迫0 h的12倍，差異達極顯著水平(圖4B)。推測在小麥響應鹽脅迫過程中發揮一定的功能，且其參與的鹽脅迫調控機制在品種間存在一定差異。

圖4 鹽脅迫條件下 Ta-MIR154的表達分析Fig.4 Expression of Ta-MIR154 under salt stress

3 討 論

小麥是典型的異源六倍體植物，含有A、B和D部分同源的3個基因組，大多數基因在小麥基因組中均存在3個部分同源的基因成員。因此，小麥基因組中廣泛存在基因冗余現象，而且部分同源基因間往往具有功能互補的特性。本研究中，、和基因序列間存在一定差異，特別是在成熟miRNA對應位置由于一個核苷酸的差異導致其不能生成；而和在miRNA前體區域高度相似，而且miRNA前體序列都可形成典型的莖環結構，推測和兩個基因均具有生成的能力。不過，由于和兩個基因在miRNA前體區域存在兩個堿基的差異，且導致RNA折疊后頂端兩個環狀結構發生微小的變化，這是否會影響到成熟的生成，仍需進一步證實。

植物在抵御逆境脅迫過程中涉及到一系列的生理響應和基因表達調控過程，已有研究表明，依賴于miRNA表達的基因在植物對逆境脅迫響應過程中發揮重要調控功能，Liu等研究還發現，依賴于miRNA的調控機制可能與小麥的脅迫記憶和跨代效應有關。本研究發現，對干旱和高鹽脅迫的響應模式在兩個小麥品種中不同，這可能與兩個品種具有不同的抗逆特性有關。對基因組序列分析也發現，該基因上游調控區包含有防御和應激反應元件(TC-rich repeats)、脫落酸響應元件(ABRE)和脅迫誘導轉錄因子MYB，進一步說明參與滲透脅迫響應過程。另外，小麥籽粒成熟后期實際上也是一個干物質積累和籽粒脫水的調控過程，小麥籽粒脫水特性也直接關系到籽粒機收效率和安全貯藏問題；本研究發現，在籽粒成熟期迅速上調表達，推測其可能與籽粒脫水調控相關。在滲透脅迫響應過程中的調控功能仍有待進一步研究。