小麥DEAD-box基因家族鑒定及其低溫下的表達模式分析

齊 越，于 晶，蒼 晶，田 宇，彭瞰看，王多佳，王政委，任治鵬，梁 伊，王曉楠，孟 婧

(1.東北農業大學生命科學學院，黑龍江哈爾濱 150030； 2.東北農業大學農學院，黑龍江哈爾濱 150030)

RNA分子在RNA代謝過程中會經歷一系列修飾[1]，其自身的不穩定性容易引起RNA代謝紊亂[2]，進而會在不同程度上影響植物的生長發育和對逆境脅迫的抵抗能力[3-4]。

DEAD-box RNA解旋酶屬于解旋酶家族的SF2家族，作為最大的解旋酶家族，DEAD-box RNA解旋酶參與轉錄、翻譯、mRNA前體剪接、核糖體生物發生、mRNA核-質輸出以及RNA無義衰變等RNA代謝過程，調控植株的生長發育與抗逆性[5-25]。部分DEAD-box RNA解旋酶缺失可能抑制植物生長發育，甚至導致植株死亡。不同非生物脅迫會引起不同DEAD-box解旋酶基因的表達量發生變化，從而提高植株的脅迫耐受能力[5]。擬南芥中，DEAD-box家族基因AtRH3、AtRH7、AtRH9、AtRH25、AtHELP、LOS4和RCF1均響應低溫脅迫[6-8]，其中，AtRH3和AtRH7完全缺失會導致植株死亡[7-8]。水稻中，DEAD-box家族基因TCD33可提高水稻耐寒能力，缺失突變體tcd33表現出子葉白化表型，說明TCD33是葉綠素合成的必需基因[9]；另外，OsRH42也可提高水稻的抗寒能力[10]。甘藍中，DEAD-box家族基因BrRH22除響應低溫脅迫外，還響應干旱脅迫和鹽脅迫[11]。除此之外，前人還發現，多個物種的DEAD-box基因家族成員均響應逆境脅迫，如龍眼DlDDX、小立碗蘚eIF4A1、番茄SlDEAD39、擬南芥AtRH17和大豆P68均響應鹽脅迫[12-16]；水稻OsRH58、小立碗蘚eIF4A1和擬南芥AtRH8均響應干旱脅迫[17-19]。但目前關于小麥DEAD-box基因家族成員參與植物非生物脅迫抵抗的研究尚未見報道。

為了解小麥DEAD-box基因的功能，本研究對小麥DEAD-box基因家族成員進行全基因組鑒定，并對本課題組前期在轉錄組與蛋白磷酸化數據庫中篩選獲得的7個差異表達的小麥DEAD-box基因(未發表)進行表達模式分析，以期為小麥DEAD-box基因的功能研究奠定 基礎。

1 材料與方法

1.1 小麥DEAD-box基因家族成員的鑒定及其特征分析

從Ensembl Plants數據庫(http://plants.ensembl.org/index.html)下載小麥全基因組序列文件及其基因注釋文件，從UniProtKB/Swiss-Prot數據庫(https://www.uniprot.org/uniprot/? query=reviewed:yes)下載已確認的60個水稻DEAD-box基因，并以此為參照(基因提取比例為1∶5，并去除重復基因)從小麥全基因組數據庫中檢索小麥DEAD-boxRNA解旋酶家族基因。在Pfam數據庫(http://pfam.xfam.org/)中進行結構域預測，人工篩選掉預測錯誤的DEAD-box基因模型，確認小麥DEAD-box家族基因成員。

用ExPASy網站的Compute pI/MW tool軟件(https://web.expasy.org/ compute_pi/)分析小麥DEAD-box基因家族蛋白的相對分子質量和等電點。用Softberry網站的ProtComp 9.0軟件(http://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=protcomppl& group=programs&subgroup=proloc)對小麥DEAD-box基因家族蛋白進行亞細胞定位預測。

1.2 TaDEAD-box蛋白系統發育樹的構建及其保守結構域和基因結構分析

用MEGAX(https://www.megasoftware.net/)軟件中的Clustal W對小麥、擬南芥和水稻DEAD-box基因家族蛋白序列進行序列比對，用最大似然法(maximum Likelihood，ML)和最優進化模型LG+G構建系統發育樹，bootstrap值設置為1 000。用MEME軟件(https://meme-suite.org/meme/tools/meme)分析小麥DEAD-box基因家族蛋白保守基序，位點分布方式為Zero or One Occurrence per Sequence(zoops)，檢索基序數量為9。用Pfam數據庫對小麥DEAD-box基因家族進行蛋白保守結構域分析，E-value≤1.0。用GSDS 2.0軟件(http://gsds.gao-lab.org/)對小麥DEAD-box基因家族進行基因內含子和外顯子結構分析。

1.3 DEAD-box基因家族的共線性分析

從Phytozome數據庫(https://data.jgi.doe.gov/refine-download/phytozome)下載水稻和擬南芥的全基因組序列文件及其基因注釋文件。用Circos軟件從小麥基因組數據庫中提取物理位置信息，將所有小麥DEAD-box基因定位到染色體上。使用小麥與水稻、擬南芥全基因組文件相互對照提取，每個基因提取數≤30。用多重共線性掃描工具MCScanX對基因重復事件進行分析，參數為默認值。使用KaKs_Calculator 2.0計算每個重復DEAD-box基因的非同義替換(ka)和同義替換(ks)，構建小麥種內共線性圖譜和小麥與水稻、擬南芥的種間共線性圖譜。

1.4 小麥DEAD-box基因家族在低溫下的表達模式分析

對本課題組前期轉錄組數據庫分析發現，Dn1分蘗節含有大量與低溫脅迫相關的DEAD-box RNA解旋酶基因，對其進行篩選整合，獲得7個低溫脅迫下表達量變化較為明顯的DEAD-box基因(TaRH7、TaRH30、TaRH20、TaRH10-1、TaRH10-2、TaRH35和TaRH5)(未發表)，本研究對這7個DEAD-box基因進行表達模式分析。供試材料為強抗寒冬小麥品種Dn1和Dn2。

Dn1和Dn2種子于2020年9月12日播種于東北農業大學試驗田(行長4 m，行距0.2 m，播種深度5 cm)，田間常規管理。在大田自然降溫連續10 d平均最低溫度分別為5、0、-10和 -25 ℃時，剪取分蘗節和葉片，置于-80 ℃冰箱保存。

表1 組織特異表達檢測所需的引物Table 1 Primers for tissue specific expression detection

2 結果與分析

2.1 小麥DEAD-box基因家族鑒定結果、蛋白質理化性質及亞細胞定位

根據60個水稻DEAD-box基因的蛋白序列，在Ensembl Plants小麥全基因組數據庫中共鑒定到134個小麥DEAD-box基因(表2)。理化性質分析發現，小麥DEAD-box家族基因編碼的蛋白序列長度為408～1 276 aa，等電點為 4.99～10.17。109個小麥DEAD-box蛋白等電點大于7，為弱堿性蛋白；25個小麥DEAD-box蛋白等電點小于7，為弱酸性蛋白。亞細胞定位分析發現，78個小麥DEAD-box蛋白定位于細胞核中，19個定位于細胞外基質中，9個定位于原生質膜中，21個定位于細胞質中，6個定位于線粒體中，1個定位于葉綠體中。

表2 小麥中鑒定出的DEAD-box家族基因Table 2 DEAD-box family genes identified in wheat

(續表2 Continued table 2)

2.2 小麥、水稻和擬南芥DEAD-box家族蛋白系統發育樹分析

利用MEGAX軟件對小麥、水稻和擬南芥DEAD-box基因家族進行系統進化分析。結果(圖1)發現，通過拓撲結構域分區可將DEAD-box基因分為12組。其中，L組中DEAD-box基因最多，共有60個DEAD-box基因，包含30個小麥DEAD-box基因、16個水稻DEAD-box基因和14個擬南芥DEAD-box基因。F組、G組和H組中DEAD-box基因較少，均有5個DEAD-box基因，包含3個小麥DEAD-box基因、1個水稻DEAD-box基因和1個擬南芥DEAD-box基因。各組中小麥DEAD-box基因數量均最多，可能與其基因組較大有關，各組中水稻和擬南芥的DEAD-box基因數量相近。

紅色、藍色和綠色字體分別表示冬小麥、擬南芥和水稻DEAD-box家族基因。Red,blue and green fonts represent the DEAD-box family genes of winter wheat,Arabidopsis and rice,respectively.圖1 小麥、水稻和擬南芥DEAD-box基因的系統進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of DEAD-box genes in wheat,rice and Arabidopsis

小麥、水稻和擬南芥三個物種中DEAD-box基因保守性較高。進化樹分析發現，同物種的部分同源DEAD-box基因均位于同一組，如TaRH7、TaRH13、TaRH14等。同一組中小麥與水稻DEAD-box基因家族成員聚類關系較近，而與擬南芥較遠，原因可能是水稻和小麥均為禾本科單子葉植物。

2.3 小麥DEAD-box基因結構及蛋白保守結構域分析

為深入了解小麥DEAD-box基因家族的進化過程，構建小麥DEAD-box蛋白進化樹，根據拓撲結構分區可將鑒定到的134個DEAD-box蛋白劃分為11組(圖2a)。核心基序分析發現，大部分小麥DEAD-box家族基因均具有排列相似的9個核心基序，部分DEAD-box家族基因只有7或8個基序，如TaEif4A3缺乏motif I和motif IV，TaRH38缺乏motif Ib和motif VI，TaRH39缺乏motif IV，TaRH50缺乏motif VI。不同組中部分DEAD-box蛋白DEAD結構域(一般由motif Q、motif I、motif Ia、motif Ib、motif II和motif III組成)的核心基序排列順序存在差異；而Helicase C結構域(一般由motif IV、motif V和motif VI組成)中的核心基序排列順序均相同(圖2b和圖3)?；蚪Y構分析發現，小麥DEAD-box基因家族成員的內含子分布不均勻，數量為1～15個。保守結構域分析發現，小麥DEAD-box基因家族蛋白均含有DEAD與Helicase C保守結構域，其中DEAD結構域含有的內含子數為0～6個，Helicase C結構域含有的內含子數為0～3個。同一組大部分小麥DEAD-box基因均具有相似的結構，可能存在串聯重復基因。

A：小麥DEAD-box進化樹。通過拓撲結構分析將小麥DEAD-box蛋白分成11組，不同顏色代表不同組。B：小麥DEAD-box核心基序分布分析。C：小麥DEAD-box結構域與基因結構圖。A:Phylogenetic tree of wheat DEAD-box proteins.The TaDEAD-box proteins were divided into 11 regions by topology analysis,and different colors represent different groups.B:Distribution analysis of core motif of wheat DEAD-box.C:Dead-box domain and gene structure of wheat.圖2 小麥DEAD-box進化樹、核心基序、結構域和基因結構分析Fig.2 Phylogenetic tree,core motifs,domain and gene structure analysis of the DEAD-box gene family

圖3 小麥TaDEAD-box蛋白家族核心基序示意圖Fig.3 Schematic diagram of the core motifs of the wheat DEAD-box gene family

2.4 小麥DEAD-box基因染色體分布與共線性分析

從基因在染色體上的分布來看，小麥各染色體上均有DEAD-box基因分布，但分布不均勻。

其中5A染色體上分布數量最多，含有13個DEAD-box基因；7D染色體上分布數量最少，僅有1個DEAD-box基因(圖4)。

從共線性分析結果來看，分布于同一基因組不同染色體上的小麥DEAD-box基因普遍存在共線性，說明其大多數基因為同源染色體上的等位基因，在進化上具有高度保守性。而值得注意的是，5A染色體上的TaRH29-1基因與4D染色體上的TaRH29-3基因之間存在共線性關系；5A染色體上的TaRH50-1、TaRH50-2和TaRH50-3基因與4B染色體上的TaRH29-2基因之間存在共線性關系；6A染色體上的TaRH8-3基因與2A、2B和2D染色體上的TaRH13-1、TaRH13-2和TaRH13-3基因之間存在共線性關系；2D染色體上的TaRH13-2基因與6A、6B和6D上的TaRH8-1、TaRH8-2和TaRH8-3基因之間存在共線性關系(圖4)。這些結果表明，小麥中DEAD-box基因可能是由基因復制產生的，節段性復制事件對小麥DEAD-box蛋白的進化起著重要的推動作用。

圖4 小麥DEAD-box基因在染色體上的分布Fig.4 Distribution of wheat DEAD-box gene on chromosomes

種間共線性分析發現，小麥與水稻的DEAD-box基因共線性連線數量遠多于小麥與擬南芥的共線性連線數量(圖5)。小麥和擬南芥基因組中，僅有6個小麥DEAD-box基因存在共線性關系，分別位于2A、2B、2D、4A、4B、4D和6B染色體上，與擬南芥2號、3號和5號染色體上的3個基因存在共線性關系。小麥和水稻基因組中，除水稻的11號染色體外，其他染色體上共有38個水稻DEAD-box基因與小麥基因組中的83個小麥DEAD-box基因存在共線性關系。其中，水稻1號染色體的7個DEAD-box基因與小麥3A、3B和3D染色體上15個DEAD-box基因發生有序配對。這說明水稻1號染色體和小麥3號染色體在DEAD-box基因進化的線性關系上存在高度的保守性和一致性。值得注意的是，有3個水稻DEAD-box基因與小麥不同基因組上的DEAD-box基因發生了共線性配對，如水稻2號染色體上的OsEif4A3與小麥的6B、7A和7B染色體上的TaEif4A3C、TaEif4A3D、TaEif4A3B發生共線性配對；水稻2號染色體上的OsRH8和4號染色體上的OsRH6均與小麥1號染色體上的TaRH12-2(1A)和TaRH12-3(1B)以及6號染色體上的TaRH8-1(6A)、TaRH8-2(6B)和TaRH8-3(6D)發生共線性配對，推測這些基因所在的染色體可能在進化上發生過異位突變。

圖5 小麥、水稻和擬南芥DEAD-box基因的共線性關系Fig.5 Collinearity of DEAD-box genes among wheat,rice and Arabidopsis

2.5 低溫脅迫下差異表達的小麥DEAD-box基因的表達模式

Dn1分蘗節中基因的表達量分析結果(圖6)顯示，隨著溫度的降低，TaRH7的表達量呈先降后升的變化趨勢，在-25 ℃時達到最大值，顯著高于5 ℃和0 ℃時的表達量，但與 -10 ℃時的表達量無顯著差異。TaRH30的表達量呈升-降-升的變化趨勢，在-25 ℃時達到最大值，顯著高于5 ℃和-10 ℃的表達量，但與0 ℃時的表達量無顯著差異。TaRH20、TaRH10-1、TaRH10-2、TaRH35和TaRH5的表達量均呈先升后降的變化趨勢，TaRH20與TaRH5的表達量在0 ℃時達到最大值，均顯著高于-10 ℃和-25 ℃時的表達量，但與5 ℃時的表達量無顯著差異；TaRH10-1、TaRH10-2和TaRH35的表達量均在-10 ℃時達到最大值，其中TaRH10-1和TaRH35顯著高于5 ℃、0 ℃和-25 ℃的表達量，TaRH10-2顯著高于5 ℃時的表達量。7個小麥DEAD-box基因中，TaRH10-1和TaRH35對低溫脅迫的響應較為明顯，在-10 ℃時表達量最高，約為5 ℃時表達量的5倍。

Dn1葉片中基因的表達量分析結果(圖6)顯示，隨著溫度的降低，TaRH7、TaRH10-1和TaRH35的表達量呈緩慢上升趨勢，-25 ℃時達到最大值，顯著高于5 ℃、0 ℃和-25 ℃的表達量；TaRH30、TaRH20、TaRH10-2和TaRH5的表達量呈先升后降的變化趨勢，在-10 ℃達到最大值，且TaRH20、TaRH10-2和TaRH5的表達量顯著高于5 ℃、0 ℃和-25 ℃的表達量，而TaRH30在各溫度間的表達量無顯著差異。7個小麥DEAD-box基因中，TaRH10-2對低溫脅迫的響應較為明顯，在-10 ℃時的表達量最高，約為5 ℃時表達量的85倍。

Dn2分蘗節中基因的表達量分析結果(圖6)顯示，隨著溫度的降低，TaRH7、TaRH30、TaRH20、TaRH10-2和TaRH5的表達量呈升-降-升的變化趨勢，其中，TaRH7、TaRH30和TaRH10-2的表達量在-25 ℃達到最大值，顯著高于5 ℃、0 ℃和-25 ℃的表達量；而TaRH20和TaRH5的表達量在0 ℃時達到最大值，均顯著高于5 ℃和-10 ℃的表達量。TaRH10-1的表達量呈先升后降的變化趨勢，在-10 ℃達到最大值，顯著高于5 ℃、0 ℃和-25 ℃的表達量。TaRH35的表達量呈降-升-降的變化趨勢，在-10 ℃達到最大值，顯著高于0 ℃和-25 ℃的表達量，但與5 ℃時的表達量無顯著差異。7個小麥DEAD-box基因中，TaRH7、TaRH30、TaRH10-1和TaRH10-2對低溫脅迫的響應較為明顯，TaRH7和TaRH30在-25 ℃時的表達量約為5 ℃表達量的10倍，TaRH10-1和TaRH10-2在-25 ℃時的表達量約為5 ℃時表達量的5倍。

Dn2葉片中基因的表達量分析結果(圖6)顯示，隨著溫度的降低，TaRH7、TaRH30、TaRH20和TaRH10-2的表達量呈升-降-升的變化趨勢，在-25 ℃時達到最大值，均顯著高于5 ℃、0 ℃和-25 ℃的表達量。TaRH5的表達量呈持續升高趨勢，均在-25 ℃時達到最大值，顯著高5 ℃、0 ℃和-10 ℃的表達量。TaRH10-1和TaRH35的表達量在各溫度間無顯著差異。7個小麥DEAD-box基因中，TaRH10-2對低溫脅迫的響應較為明顯，在-25 ℃時的表達量最高，約為5 ℃時表達量的125倍。

*、**、***和****分別表示基因間的表達量在 0.05、0.01、 0.001和0.0001水平上差異顯著。*,**,*** and **** indicate significant differences between genes at 0.05,0.01,0.001 and 0.0001 levels.圖6 低溫脅迫下Dn1和Dn2的葉片和分蘗節中DEAD-box基因的表達模式分析Fig.6 Expression patterns of DEAD-box in leaves and tillering nodes of Dn1 and Dn2 under cold stress

3 討 論

3.1 DEAD-box解旋酶進化關系分析

從種間進化樹分析看，小麥與水稻DEAD-box解旋酶的親緣性高于擬南芥，且種間共線性分析發現，小麥與水稻DEAD-box基因存在共線性的數量遠多于小麥與擬南芥DEAD-box基因存在共線性的數量。原因可能是單子葉與雙子葉植物在DEAD-box解旋酶進化過程中存在進化差異。種間進化樹同一組內均存在三物種的DEAD-box解旋酶，說明DEAD-box解旋酶在單子葉與雙子葉分化之前就已經存在[20]。從種內進化樹分析看，TaRH9-1、TaRH9-2和TaRH2基因在進化分支上相近，TaRH47B和TaRH3-4基因在進化分支上相近，推測它們具有相似的分子 功能。

3.2 小麥DEAD-box解旋酶結構分析與功能 預測

DEAD-box RNA解旋酶幾乎參與所有RNA代謝活動[21]，根據其參與RNA代謝的種類和行使功能的空間定位可以大致判斷其分子功能。另外，DEAD-box RNA解旋酶在進化中保持高度的保守性[1]。DEAD-box RNA解旋酶的功能依賴于其高度保守的核心基序組成與排列，在不同物種間DEAD-box RNA解旋酶的功能具有較高的相似性，在同源物種間該相似性更為明顯。

從結構域分析發現，本研究中所有小麥DEAD-box蛋白均有其特征性結構域DEAD和Helicase C，部分DEAD-box解旋酶含有特殊結構域，如TaEIF4A2C和TaRH35含有C2H2鋅指結構域，TaRH41含有HIT鋅指結構域。而鋅指結構域能夠提高解旋酶RNA結合活性[22]，并提高植株非生物脅迫抗性[23]。推測這3個DEAD-box蛋白也參與逆境脅迫。本研究還發現，TaRH3與TaRH7均含有GUCT結構域。而小立碗蘚中含有GUCT結構域的DEAD-box解旋酶可調控孢子體和配子體發育[24]，此外，擬南芥中TaRH7基因缺失會導致擬南芥配子體發育畸形，抑制種子萌發[8]。由此推測，小麥中TaRH3與TaRH7基因也可能具有相似功能。

從核心基序分析發現，本研究中大多數小麥DEAD-box解旋酶主要由motif Q、motif I、motif Ia、motif Ib、motif II、motif III、motif IV、motif V、motif VI九個核心基序組成，部分DEAD-box解旋酶存在部分核心基序缺失的現象。如TaEIF4A3缺乏motif I和motif IV，TaRH38缺乏motif Ib和motif VI，TaRH39缺乏motif IV，TaRH50缺乏motif VI。DEAD結構域中的motif Q和motif I、motif II可能參與ATP結合和水解；motif III可能與ATP水解和解旋酶活性的偶聯有關；motif V可能通過糖-磷酸基骨架與底物結合，并與NTP相互作用；motif VI可能與ATP磷酸鹽的結合有關，而這種基序功能的喪失與某些DEAD-box蛋白的ATP水解功能受損有關；motif Ia、motif Ib、motif IV可能參與核酸結合誘導的ATP水解[25-26]。由此猜測，部分DEAD-box解旋酶缺失的基序可能引起相應的分子功能缺失，或由其他基序彌補其分子功能。

3.3 小麥DEAD-box RNA解旋酶參與冬小麥抵抗低溫脅迫

對冬小麥分蘗節和葉片的7個DEAD-box基因進行qRT-PCR定量分析，發現不同品種和不同組織中DEAD-box基因的表達模式隨溫度的變化差異較大，其中葉片中DEAD-box基因對低溫的響應比分蘗節更為強烈，如Dn1葉片中TaRH10-2基因在-10 ℃時的表達量約為5 ℃時表達量的85倍，Dn2葉片中TaRH10-2基因在-25 ℃時的表達量約為5 ℃時表達量的125倍，遠高于分蘗節中TaRH10-2基因的表達量變化幅度，這可能是由于葉片組織在地上部，會受到低溫和風干缺水的雙重影響[11,17-19]，而分蘗節在地下，受土壤層的保護，在一定程度上地下溫度會略高于地上溫度，受風干失水的影響較小，因此，葉片對低溫脅迫的敏感性比分蘗節更強。不同品種中DEAD-box基因家族成員對冷脅迫的響應速度不同。如Dn1中DEAD-box基因家族表達量峰值普遍在-10 ℃，而Dn2的DEAD-box基因家族表達量峰值普遍在-25 ℃，響應冷脅迫基因激活時間的差異可能會對不同冬小麥品種抗寒能力與植株生理長勢產生影響。

總之，鑒于小麥DEAD-box基因的多樣性和重要功能，對小麥DEAD-box基因家族進行系統的功能研究十分必要。本研究為小麥DEAD-box基因功能的解析奠定了基礎，對進一步了解多倍體植物DEAD-box基因的特點，挖掘優異抗低溫基因資源，培育作物抗低溫新品種，具有重要的理論和實踐意義。