副豬嗜血桿菌病檢測技術

黃 利，袁東波，曹省艷，尹念春

（1.四川省閬中市農業農村局，四川 閬中 637400；2.四川省動物疫病預防控制中心，四川 成都 610041；3.四川省綿陽市動物疫病預防控制中心，四川 綿陽 621000；4.四川省遂寧市動物疫病預防控制中心，四川 遂寧 629000）

副豬嗜血桿菌病又稱多發性纖維素性漿膜炎和關節炎，由副豬嗜血桿菌（Hps）引起。

病豬主要癥狀為發熱、咳嗽、呼吸困難、行動障礙等。該病2 周齡至4 月齡仔豬，特別是斷奶期和保育期仔豬多發，發病率可高達40%，病死率達50%～90%，成年豬病死率稍低。該病多為慢性經過，致病菌易和豬鏈球菌、豬丹毒桿菌和豬放線桿菌等引起敗血性細菌感染。

1 血清學檢測

間接血凝試驗（IHA）、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）等基于抗體的血清學檢測方法是常見及快速的副豬嗜血桿菌檢測方法。

1.1 間接血凝試驗（IHA）IHA 檢測豬抗Hps，其原理是經酸處理后的紅細胞易吸附Hps 抗原，在抗血清存在的環境下，與紅細胞發生凝集。在建立間接血凝試驗時，有研究者提取莢膜作為IHA 抗原，建立了較高特異性和敏感性的檢測方法。有的將分離的3個型的菌體超聲產物致敏后作為診斷抗原，建立了檢測Hps抗體的IHA，其敏感性和特異性都優于瓊脂擴散試驗。

以Hps 7 型GS122 株滅活菌體為抗原，建立了微量凝集試驗抗體檢測方法。研究者利用豬瘟、豬鏈球菌病等9 種常見豬病陽性血清檢測了該方法的特異性，利用4、5、12型檢測了該方法的交叉反應，也進行了敏感性、重復性實驗等，結果均較好。該方法加速了對副豬嗜血桿菌7型的疫苗免疫評價和流行病學調查的進度。

1.2 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）與間接血凝試驗相比較，間接ELISA 方法敏感性更高、準確性更好和特異性更優。

選擇合適的包被抗原是建立間接ELISA 檢測方法的關鍵。以莢膜多糖和純化蛋白作為包被抗原的間接ELISA 方法在臨床診斷、免疫評價和流行病學調查中得到廣泛運用。基于純化的TbpA 蛋白作為包被抗原建立的Hps 抗體間接ELISA 檢測方法，檢測免疫抗體陽性率高，為免疫實時評價提供技術支撐。以Neu 作為包被抗原構建的間接ELISA 檢測方法具有高特異性。基于黏附素蛋白的ELISA 檢測方法能有效區分Hps 陰性血清和陽性血清，通過優化參數，研究了可應用于滅活疫苗免疫后的抗體監測和HPS的血清抗體檢測。

2 病原學檢查

2.1 細菌分離 副豬嗜血桿菌分離培養較為困難，采集經抗生素治療后的病豬樣品進行細菌分離培養難度更大。理想的Hps樣本應來自既有該病特征性癥狀，又尚未使用抗生素治療的急性發病豬。

2.2 免疫組化技術（IHC）由于各種細菌的交叉感染、繼發感染，病豬臨床上多表現為非特征性發病經過，這增加了臨床診斷的難度。

組織學病變診斷解決了這一難題，利用福爾馬林固定和石蠟包埋組織的免疫組化法可以敏感、直觀的檢測Hps 抗原，但運用此方法獲得的抗副豬嗜血桿菌單克隆抗體非常少，限制了此法在臨床診斷上的運用，因此其多用于研究發病機理。

3 分子生物學檢測

3.1 聚合酶鏈式反應（PCR）有研究者建立了基于SYBR Green I 的快速檢測Hps 的實時熒光定量PCR 方法，其敏感性比常規PCR 高，試驗重復性好，同時對Hps具有良好的特異性，較大提高了臨床診斷中低濃度樣品檢測的準確性。

研究者建立的基于PPV、PCV2、Hps 的三重實時定量熒光PCR，解決了臨床中混合感染難以快速診斷的難題，也為三種疫病的免疫程序修訂提供了依據。

3.2 腸桿菌科基因間重復序列PCR（ERICPCR）以腸桿菌科基因間重復序列（ERIC）為引物，可擴增未知細菌的基因序列，從而對具有菌株特異性的指紋圖譜進行分析。

該技術在菌株特異性分析和描述上較血清學分型更準確。在流行病學調查中，對于場點間流行毒株的分析，此技術體現出了優勢。

3.3 寡核苷酸特異性捕獲圓盤雜交（OS-CPH）

代替細菌分離的技術還有寡核苷酸特異性捕獲圓盤雜交（OS-CPH）試驗，其敏感性可達到濃度低于100 CFU/mL的細菌，解決了臨床診斷對低樣品濃度的限制。該技術的時效性也優于細菌培養，可在24 h內得到結果。

在特異性方面，通過對15種豬體分離細菌所提取的DNA 樣品的比較，均為陰性，此技術在確定發病豬場的流行情況中得到運用。

3.4 基因芯片檢測技術 基因芯片技術在檢測中的高通量、自動化等優勢凸顯。

有研究者建立了Hps和豬細小病毒基因芯片雙重檢測技術，該技術特異性、重復性均較好，固定的芯片4 ℃放置2個月后穩定性和重復性仍然很好，有效提高了臨床診斷的時效性，也為基因芯片診斷技術的應用提供了前景。

3.5 納米PCR檢測方法 該方法基于納米流體強大的熱導性，控制PCR反應過程中的溫度和時間，減少非特異性擴增，提高PCR 特異性產物。該技術在非洲豬瘟病毒檢測上的運用證明，PCR反應效率得到有效提升，敏感性大幅提高，最低核酸檢出量達到10個拷貝。

有研究者用建立的納米PCR 檢測Hps 與其他4種豬源細菌，以驗證該納米PCR的特異性，結果表明無非特異性擴增產物。該方法的敏感性比普通PCR 高10 倍，最低可檢出4 個拷貝的Hps基因組DNA。因其較好的特異性和較高的靈敏度，該方法可為副豬嗜血桿菌病的防控和檢驗檢疫提供技術支撐。

3.6 環介導等溫擴增技術（LAMP）該技術利用Hps 的16S r RNA 序列設計引物，在酶的作用下進行環介導等溫擴增出特異性的產物。

試驗證明該方法敏感性比PCR 高，特異性良好，檢測結果肉眼可見，實驗操作簡便，1 h 內能完成樣品的檢測，適用于基層進行現場快速診斷。

4 血清型與毒力因子測定

副豬嗜血桿菌的毒力在不同血清型之間存在變異，在同一血清型不同菌株之間也存在變異，這種毒力差異可能是由不同的基因表達方式所導致的。

據報道通過RT-PCR 技術對其離子轉運蛋白相關基因（cirA）、溶血素相關基因（hhdBA）、抗菌素相關基因（copha）進行檢測，發現具有毒力性的血清型中，約有一半多的血清型存在上述情況。