響應(yīng)面法優(yōu)化堿性蛋白酶水解豆渣蛋白質(zhì)的研究

郎佳雪，劉暢，趙淼，張茂迎，周云博，羅匯鴻，鄒險峰，李險峰

（長春大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130022）

大豆中包含人體所需要的蛋白質(zhì)、膳食纖維、碳水化合物等7種營養(yǎng)素，能夠滿足人類生命活動的需求[1]。大豆還含有多種有效成分，具有多種功能活性，如低聚糖可保護胃腸道、降低碳水化合物以及脂類的代謝，異黃酮和皂苷具有抗疲勞、預(yù)防癌癥、骨質(zhì)疏松等功效，能夠滿足人類醫(yī)療保健的需求[2-5]。蛋白質(zhì)是大豆中一種重要的營養(yǎng)成分，含量達到40%左右，其中90%左右為可溶性蛋白，大豆蛋白質(zhì)包含人體全部的必需氨基酸，其中賴氨酸含量豐富，與谷類主食形成互補，是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白食源[6-9]。營養(yǎng)學研究表明，人類攝取植物蛋白和動物蛋白理想比例在兒童時應(yīng)為1∶1，隨年齡增長，植物蛋白攝取比例逐漸提高，在老年時達到 4∶1[10]。

目前市售大豆蛋白產(chǎn)品豐富，包括大豆分離蛋白、大豆組織蛋白和大豆蛋白粉等，并被添加到面制品、肉制品和乳品等各類食品中。大豆肽是大豆蛋白質(zhì)的水解產(chǎn)物，分子小吸收率高，具有預(yù)防肥胖、降低血脂、調(diào)節(jié)免疫力、預(yù)防骨質(zhì)疏松、緩解疲勞、延緩衰老等功能[11-12]，馬福建等[13]研究表明大豆球蛋白水解肽具有清除超氧陰離子自由基和羥自由基的功能。楊柏崇等[14]研究表明大豆中β-伴大豆球蛋白被水解產(chǎn)生的大豆肽具有抗氧化的功能。證明了大豆肽具有抑制和清除體內(nèi)自由基的作用，從而能夠減少機體內(nèi)自由基引發(fā)的生理功能障礙，減少各種老年性疾病的發(fā)生[15]。制備大豆肽的關(guān)鍵技術(shù)是蛋白質(zhì)的水解，酶解法具有反應(yīng)條件溫和、不破壞氨基酸的結(jié)構(gòu)、無副反應(yīng)發(fā)生等優(yōu)點，被食品工業(yè)廣泛采用[16-17]。江連洲等[18]采用堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風味蛋白酶、菠蘿蛋白酶和胰蛋白酶水解制備大豆肽，結(jié)果表明堿性蛋白酶的水解能力最強。佟曉紅等[19]研究表明堿性蛋白酶比風味蛋白酶水解產(chǎn)生的大豆肽清除自由基的能力強。因此本研究采用堿性蛋白酶，以水解度作為指標來評價豆渣蛋白的水解。

我國有加工食用大豆的傳統(tǒng)，《本草綱目》中記載了“豆腐之法，始于前漢淮南王劉安”，已經(jīng)開發(fā)出豆腐、豆?jié){、豆醬等多種大豆制品。目前我國已經(jīng)成為世界上最大的大豆進口國和消費國，在2020年大豆進口量超過1億噸。在豆制品加工過程中會產(chǎn)生大量殘渣——豆渣，加工生產(chǎn)1噸豆腐會產(chǎn)生1.2噸濕豆渣[20]。由于大豆蛋白質(zhì)中含有10%左右的不溶性蛋白，在加工過程中很難分離，會殘留在豆渣中[21]。有研究表明，豆渣中殘留的蛋白質(zhì)含量達15.2%～33.4%[22]。新鮮豆渣中包含蛋白質(zhì)、碳水化合物等營養(yǎng)成分能夠給微生物提供充足的營養(yǎng)和濕度，故不易保存、易腐敗、很難直接作為飼料應(yīng)用。將豆渣作為廢渣處理，不僅會對環(huán)境造成污染，同時造成部分大豆蛋白資源被浪費[23-24]。

為使豆渣蛋白得到合理利用，研究采用堿性蛋白酶水解豆渣蛋白，通過響應(yīng)面法優(yōu)化酶解工藝條件，獲得大豆蛋白水解肽，通過DPPH法檢測水解肽的抗氧化性。該水解肽可以應(yīng)用于功能型飲料、面制品、調(diào)味品等食品和保健品中[25]。豆渣酶解后的剩余產(chǎn)物主要為纖維素成分，可進一步研究開發(fā)，實現(xiàn)大豆的完全利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮豆渣：市售；堿性蛋白酶（酶活力100000U/g）：無錫市酶制劑廠；2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）：美國 Sigma公司；硫酸鉀、硫酸、鹽酸、次甲基藍（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電熱鼓風干燥箱（BGZ-146）:上海博訊實業(yè)有限公司；精密pH計（PHS-3C）：上海雷磁儀器廠；恒溫水浴鍋（HH6）：金壇市江南儀器廠；集熱式磁力攪拌器（DF-1型）：金壇市新一佳儀器廠；循環(huán)水式真空泵(SHZ-DШ）：鞏義市予華儀器有限公司；紫外分光光度計（UV2600）：日本島津有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 豆渣前處理

新鮮的濕豆渣汽蒸30 min滅菌，50℃恒溫干燥24 h，冷卻至25℃，放置陰涼處備用。

1.3.2 豆渣蛋白質(zhì)含量的測定

蛋白質(zhì)含量的測定采用凱氏定氮法[26]。

1.3.3 豆渣蛋白質(zhì)的酶解流程及水解度的測定

稱取1 g干燥豆渣，加入20 mL蒸餾水混合均勻配成液料比為20∶1（mL/g）的豆渣懸液，按照試驗設(shè)計調(diào)節(jié)pH值，加酶，在恒溫水浴鍋中反應(yīng)一定時間，反應(yīng)結(jié)束后，100℃滅酶15 min，抽濾取上清液，用凱氏定氮法測定蛋白含量。

水解度的測定采用甲醛滴定法[27-28]，按如下公式計算。

1.3.4 單因素試驗

pH值對水解度的影響：在液料比為20∶1（mL/g），水解溫度為50℃，酶添加量為8 000 U/g，水解時間為3 h 的條件下，設(shè)定 pH 值為 8.0、8.5、9.0、9.5、10.0，測定其水解度。

水解溫度對水解度的影響：在液料比為20∶1（mL/g），酶添加量為8 000 U/g，pH值為9.0，水解時間為3 h的條件下，設(shè)定水解溫度為 40、45、50 、55、60 ℃，測定水解度。

水解時間對水解度的影響：在液料比為20∶1（mL/g），酶添加量為8 000 U/g，pH值為9.0，水解溫度為50℃的條件下，設(shè)定水解時間為 1、2、3、4、5 h，測定其水解度。

酶添加量對水解度的影響：在液料比為20∶1（mL/g），pH值為9.0,水解溫度為50℃，水解時間為3 h的條件下，設(shè)定酶添加量為 4 000、6 000、8 000、10 000、12 000 U/g，測定其水解度。

1.3.5 響應(yīng)面試驗

根據(jù)單因素試驗確定最適條件進行四因素三水平的響應(yīng)面試驗，四因素三水平的設(shè)計條件見表1。

表1 響應(yīng)面因素與水平Table 1 Response surface factors and levels

1.3.6 抗氧化試驗

由于DPPH法[29]是目前公認的穩(wěn)定且有效的抗氧化測定方法，因此采用DPPH法來測定抗氧化活性。在反應(yīng)管中加入2 mL濃度為0.4 mmol/L DPPH-乙醇溶液，再加入2 mL不同濃度的豆渣蛋白水解肽液，混合均勻，25℃避光反應(yīng)30 min后，在517 nm處測定吸光值。DPPH自由基清除率的計算公式如下。

式中：A0為2 mL無水乙醇+2 mLDPPH的吸光值；A1為2 mL樣品溶液+2 mLDPPH的吸光值；A2為2 mL樣品溶液+2 mL無水乙醇的吸光值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗重復(fù)3次，運用Design-Expert V8.0.6軟件進行響應(yīng)面設(shè)計和方差分析，Origin 2018軟件進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)測定結(jié)果

以干燥后的豆渣為原料，用凱氏定氮法測定干豆渣的蛋白質(zhì)含量為21.25%。

2.2 單因素試驗結(jié)果分析

2.2.1 pH值對水解度的影響

酶解pH值對水解度的影響見圖1。

圖1 酶解pH值對水解度的影響Fig.1 Effect of pH value of enzymatic hydrolysis on degree of hydrolysis

由圖1可知，隨著豆渣pH值的增大，豆渣蛋白質(zhì)的水解度先上升，當?shù)竭_pH9.0以后呈現(xiàn)下降的趨勢，可能pH值變化在一定程度上對堿性蛋白酶活性有一定的影響，因此水解大豆豆渣蛋白質(zhì)的較佳pH值為9.0。

2.2.2 水解溫度對水解度的影響

水解溫度對水解度的影響見圖2。

圖2 水解溫度對水解度的影響Fig.2 Effect of hydrolysis temperature on degree of hydrolysis

由圖2可知，水解度在50℃之前，隨著水解溫度的上升呈現(xiàn)上升的趨勢。說明隨著水解溫度的上升，堿性蛋白酶的酶活性也在逐漸變大；當水解溫度為50℃時，豆渣的水解度達到最大，為91.35%，表明在50℃時堿性蛋白酶的酶活性最大；水解溫度超過50℃后，豆渣蛋白質(zhì)的水解度隨著水解溫度的升高而呈現(xiàn)下降的趨勢，可能當達到一定溫度后酶開始失活。由此可知溫度過高或者過低都會影響堿性蛋白酶的酶活性。所以堿性蛋白酶在水解溫度為50℃時達到較佳水解度。

2.2.3 水解時間對水解度的影響

水解時間對水解度的影響見圖3。

圖3 水解時間對水解度的影響Fig.3 Effect of hydrolysis time on degree of hydrolysis

由圖3可知，水解前3 h豆渣蛋白質(zhì)的水解度不斷地上升，且速率較快，但是3 h之后水解速率降低，可能是水解至3 h時底物濃度和酶添加量之間達到了平衡，導致有些蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，堿性蛋白酶失活影響了豆渣蛋白質(zhì)的水解度[30-31]?？紤]實際生產(chǎn)效率，堿性蛋白酶水解大豆豆渣蛋白質(zhì)的時間為3 h較佳。

2.2.4 酶添加量對水解度的影響

酶添加量對水解度的影響見圖4。

圖4 酶添加量對水解度的影響Fig.4 Effect of enzyme addition on degree of hydrolysis

由圖4可知,當堿性蛋白酶的添加量在4 000 U/g到8 000 U/g時，大豆豆渣蛋白質(zhì)的水解度呈現(xiàn)較快的上升趨勢；酶添加量超過8 000 U/g后，豆渣蛋白質(zhì)的水解度基本不再上升。原因可能是堿性蛋白酶的濃度達到一定程度之后，過高的酶添加量使酶分子和底物中的蛋白質(zhì)分子的碰撞機會減少，從而反應(yīng)速度降低[32]。所以堿性蛋白酶水解大豆豆渣較適的添加量為8 000 U/g。

2.3 響應(yīng)面結(jié)果分析

以蛋白質(zhì)水解物的水解度作為響應(yīng)值（y），進行響應(yīng)面分析試驗。響應(yīng)面設(shè)計方案及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面的設(shè)計及結(jié)果Table 2 Response surface design and results

對模型進行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Results of ANOVA

續(xù)表3 方差分析結(jié)果Continue table 3 Results of ANOVA

由表3可知，模型中的P值遠小于0.01，模型極顯著，模型的失擬項不顯著，說明模型選擇合適。比較F值大小可知，各因素對水解度的影響大小依次為水解溫度＞水解時間＞酶添加量＞pH值。

響應(yīng)面圖見圖5～圖8。

圖5 水解時間與pH值對水解度的影響作用Fig.5 Effects of hydrolysis time and pH on degree of

圖6 水解溫度與pH值對水解度的影響作用Fig.6 Effects of hydrolysis temperature and pH on degree of hydrolysis

圖7 酶添加量與pH值對水解度的影響作用Fig.7 Effect of enzyme activity and pH on degree of hydrolysis

圖8 水解溫度與水解時間對水解度的影響作用Fig.8 Effect of temperature and time on degree of hydrolysis

等高線是響應(yīng)面中水平方向的投影，如果一個響應(yīng)曲面坡度相對較平坦，表明其可以接受自變量的因素的變化，而不影響到響應(yīng)值大小，相反，如果一個響應(yīng)曲面坡度非常陡，表明響應(yīng)值對于自變量因素的變化非常敏銳[33]。由圖5～圖8的響應(yīng)面兩因素的交互作用以及方差結(jié)果分析得出一次項 X1、X2、X3、X4極顯著；二次項 X12、X22、X32、X42極顯著；交互項 X1X2、X2X3、X2X4、X3X4、X1X4極顯著。

綜上所述，各因素對于蛋白質(zhì)水解度影響的程度順序為水解溫度＞水解時間＞酶添加量＞pH值。運用回歸方程對豆渣蛋白質(zhì)的水解工藝條件進行優(yōu)化，預(yù)測最佳水解工藝條件為pH9.23、水解時間3.05 h、酶添加量8 108.11 U/g、水解溫度53.21℃。在此條件下，豆渣蛋白質(zhì)水解度理論值為91.47%。根據(jù)實際情況，對工藝條件進行調(diào)整，調(diào)整后的最佳水解條件為pH9.25、水解時間3.05 h、酶添加量8 108 U/g、水解溫度53℃。在此條件重復(fù)驗證試驗3次，得到水解度平均值為91.23%，與理論值基本一致。

2.4 抗氧化性分析

水解肽濃度對DPPH自由基清除率的影響見圖9。

圖9 水解肽濃度對DPPH自由基清除率的影響Fig.9 Effects of concentrations of hydrolyzed peptides on DPPH radical scavenging rate

由圖9可知，豆渣蛋白水解肽的抗氧化性隨水解肽濃度的增加呈先上升后下降的趨勢，濃度在6%時DPPH自由基清除率達到最大，繼續(xù)提高水解肽濃度，DPPH自由基清除率不再提高。因此清除DPPH自由基的最佳濃度為6%，清除率達到71.32%。此結(jié)論與何曉蘭等[34]對于苦蕎抗氧化肽的研究的結(jié)果類似。

3 結(jié)論

本研究采用無污染且高效率的堿性蛋白酶水解方法，通過單因素試驗確定響應(yīng)面的自變量為酶添加量、pH值、水解溫度、水解時間，因變量為水解度。試驗表明最優(yōu)水解條件為pH9.25、水解時間3.05 h、酶添加量8 108 U/g、水解溫度53℃，水解度達到91.23%。在最優(yōu)水解條件下得到的豆渣蛋白水解肽進行抗氧化試驗，水解肽濃度為6%時DPPH自由基的清除率最大，達到71.32%。