數據挖掘鑒定PRIM1與肝細胞癌不良預后相關

丁慶林，魏艷紅, 胡康洪

(湖北工業大學中德生物醫學中心，湖北 武漢 430068)

肝細胞癌(LIHC)作為最常見的、與多種信號通路改變相關的肝原發性惡性腫瘤，是全世界癌癥相關死亡的第二大死因。大多數患者只在肝癌晚期表現出臨床癥狀，其復雜的病理生理機制導致預后很差[1]。血清甲胎蛋白(Alpha Fetoprotein , AFP)和計算機斷層掃描(Computed Tomography, CT)或磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging, MRI)的診斷成像已成為肝癌主要的診斷方式[2]。作為有價值的肝癌生物標志物，AFP、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(Glypican-3, GPC-3)、Cluster of Differentiation 147(Cluster of Differentiation 147, CD147)、黏蛋白1(Mucin-1, Muc1)和上皮細胞黏附分子(Epithelial Cell Adhesion Molecule, EpCAM)等標志物檢測的靈敏性和特異性有限[3]，應用生物標志物聯用，可提高診斷準確率，已成為臨床診斷癌癥的新方向。因此，鑒定其他小分子在肝癌中的作用具有重要意義[2]。研究發現，mRNA前加工因子3(pre-mRNA processing factor 3, PRPF3)在多個LIHC腫瘤組織中上調，與較差的總生存期(Overall Survival, OS)和無病生存期(Disease-Free Survival, DFS)相關[4]；Kelch-like)蛋白家族成員21(Kelch Like Family Member 21, KLHL21)在LIHC中上調，其表達顯著抑制細胞增殖、遷移和侵襲，代表最有可能進行治療干預的靶標[5]；核小體組裝蛋白1-like-1(Nucleosome Assembly Proteins 1-like 1 Protein, NAP1L1)在LIHC中高表達與侵襲性臨床病理特征有關，促進化療耐藥性[6]；驅動蛋白家族成員C1(Kinesin Family Member C1, KIFC1)在LIHC中表達上調，通過調節上皮細胞-間充質轉化(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)介導LIHC轉移，并且與DFS和OS顯著相關[7]。這些研究揭示了LIHC中具有預后意義的潛在基因靶標，也為PRIM1在LIHC中的研究提供了參考。

DNA引物酶亞基1(PRIM1)是異源四聚體真核聚合酶α-引物酶復合物的最小亞基，具有酶催化功能，對DNA合成具有關鍵作用，對細胞增殖同樣十分重要[8-9]。PRIM1催化的RNA合成可激活DNA損傷反應[9-10]，PRIM1異常可影響細胞周期從G1期向S期的轉變[11]；PRIM1下調和缺失可導致細胞S期停滯、延遲或延長[12]；PRIM1突變會誘導細胞凋亡[10]。研究表明，PRIM1與多種良性和惡性腫瘤疾病相關。PRIM1參與了雌激素誘導的乳腺癌形成[9]；PRIM1可能參與肺腺癌的發生[13]；PRIM1在體外和體內均可誘導肝癌細胞的增殖[14]。以上結果提示，PRIM1與多種癌癥進程相關。PRIM1在LIHC中失調，提示其可能在LIHC的發生發展中具有潛在作用。

1 材料和方法

1.1 TIMER 2.0數據庫

使用TIMER 2.0[15-17](http:∥timer.cistrome.org/)分析PRIM1在各類型癌癥中的表達情況。

1.2 GEO數據庫數據

從GEO數據庫[18-19](https: ∥ www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)挑選包含LIHC腫瘤和非腫瘤樣品的GEO基因芯片系列(GSE19665，GSE84402、GSE121248)，GEO芯片系列的平臺和樣品(表1)[20-22]。

表1 分析中包含的GEO系列詳細信息

1.3 R語言分析

使用R語言版本3.5.1，通過R Limma[23]包將每個GEO數據集的微陣列原始CEL文件進行標準化，并將標準化的基因表達水平表示為log2轉化值，比較腫瘤和非腫瘤樣品mRNA的表達。使用R clusterProfiler[24]包的enrichplot功能和GOplot[25]包將共表達基因進行GO富集分析，包括生物學過程(Biological Process, BP)，細胞成分(Cellular Component, CC)和分子功能(Molecular Function, MF)與KEGG富集分析，并輸出可視化結果。

1.4 UALCAN數據庫分析

使用UALCAN[26](http:∥ualcan.path.uab.edu)分析各個癌癥分期、腫瘤等級等腫瘤亞組中腫瘤和正常樣品中基因的相對表達。

1.5 cBioPortal數據庫分析

使用cBioPortal[27-28](http:∥cbioportal.org)分析了LIHC中PRIM1的突變情況，拷貝數變異(Copy number variation, CNV)，通過共表達模塊功能分析出排名前50的共表達基因。

1.6 Kaplan-Meier Plotter數據庫分析

使用Kaplan-Meier Plotter[29](https:∥kmplot.com/analysis/index.php?p=background)比較PRIM1高低表達組的生存時間差異。

1.7 OncoLnc 數據庫

使用OncoLnc(http:∥www.oncolnc.org/)評估驗證PRIM1對LIHC預后的影響。

1.8 The Human Protein Atlas數據庫分析

使用The Human Protein Atlas(HPA)[30](https:∥www.proteinatlas.org/)比較PRIM1蛋白在肝癌組織和正常組織中的表達情況。

1.9 細胞培養和qPCR

對HL7702(正常肝細胞系，購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫)和Hep G2(肝癌細胞系，購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫)進行10% FPS/DMEM培養，TRIZOL裂解細胞提取總RNA，逆轉錄獲取cDNA。參考PRIM1引物序列[9]，通過LightCycler 96進行實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)檢測PRIM1和內參基因β-actin的表達，評估PRIM1 mRNA在正常和肝癌細胞系中的表達情況。

2 結果

2.1 PRIM1 mRNA在LIHC中表達水平

TIMER數據庫發現，PRIM1在包括LIHC在內的多種癌癥中失調(圖1a)，GEO數據庫LIHC相關的多個GSE數據集、qPCR結果和HPA數據庫免疫組化的結果均證實了PRIM1在LIHC中高表達(圖1b-f)。

(a)PRIM1在包括LIHC在內的多種癌癥中的表達水平

2.2 PRIM1表達與臨床病理特征相關

為探究PRIM1表達量與臨床特征之間的關系，對TCGA中371例HCC樣品根據性別、年齡、種族、癌癥分期、淋巴結轉移狀態、腫瘤分級和TP53突變狀態(p<0.05)進行多亞組分析(圖2)。

(a)樣本類型 (b)性別

結果表明，PRIM1高表達且與患者性別無關(圖2b)；41-60年齡組PRIM1表達明顯高于61-80年齡組(圖2c)，可區分不同年齡段患者；高加索組PRIM1表達低于亞洲組(圖2d)，可區分不同種族；1～3期PRIM1表達高于正常組，4期出現大幅減低(圖2e)，可輔助判斷癌癥分期；無轉移組PRIM1表達高于正常組(圖2f)，可判斷是否出現轉移；3級PRIM1表達顯著高于1級(圖2g)，可輔助判斷腫瘤分級；TP53突變組顯著高于未突變組(圖2h)，表明TP53突變顯著影響PRIM1表達。以上結果表明，高PRIM1表達與LIHC多種臨床特征相關，可將PRIM1的表達作為LIHC中潛在的診斷指標。

2.3 PRIM1基因組突變和共表達基因

基因組突變與腫瘤發生密切相關[31]。為此，使用cBioPortal數據庫分析了LIHC中PRIM1的基因組改變情況。數據顯示，在353患者中有7例(2%)PRIM1 發生改變(圖3a)。這些改變包括意義未知的錯義突變1例，意義未知的截斷突變1例和擴增5例的多種改變，且存在拷貝數變異(Copy number variation, CNV)和氨基酸點位突變(圖3a-d)。以上結果提示，LIHC中發現PRIM1的基因改變，可能在LIHC的發生發展中具有潛在作用，有待深入探究。使用共表達模塊，分析出與PRIM1共表達前50個關鍵基因。

圖 3 LIHC中PRIM1的基因組突變

2.4 LIHC中PRIM1共表達基因的富集分析

PRIM1在LIHC中潛在的功能，可能是由于PRIM1基因組改變以及和多個基因共同作用的結果。為此，利用R語言 enrichplot和GOplot包對PRIM1共表達前50基因進行GO注釋和KEGG分析(圖4a-d)。

(a)生物學過程(BP)富集結

結果表明，其參與的生物學過程(BP)有：DNA復制、細胞周期檢查點、有絲分裂核分裂、有絲分裂細胞周期G1/S期過渡、細胞周期G1/S相變等。組成的細胞成分(CC)有：染色體區域、染色體著絲粒區、濃縮染色體、染色體端粒區、復制叉、MCM復合體等。涉及到的分子功能(MF)有：ATP酶活性、作用于DNA的催化活性、DNA依賴性ATP酶活性、單鏈DNA結合、DNA復制起點結合、3′-5′ DNA解旋酶活性等。參與的信號通路(KEGG)有：細胞周期、DNA復制、錯配修復、鉑耐藥等。對共表達基因進行富集分析，有助于了解PRIM1與其共表達基因在LIHC中的作用機理和過程。

2.5 PRIM1在LIHC中的預后價值

使用Kaplan-Meier Plotter數據庫評估PRIM1表達與LIHC患者的預后關系。根據PRIM1表達水平的中位數，將患者分為兩組。數據(圖5)顯示：與低表達組相比，PRIM1高表達組患者5年OS、無進展生存(Progression Free Survival, PFS)、無復發生存(Relapse Free Survival, RFS)和疾病特異性生存(Disease Free Survival, DSS)均較差(logrankp<0.05)(圖5a-d)。OncoLnc數據庫表明，PRIM1高表達與LIHC較差的OS相關。以上結果提示，LIHC中高PRIM1表達可能是一個獨立的危險因素，其導致LIHC患者的不良預后。

圖 5 PRIM1表達的Kaplan-Meier曲線

3 討論與結論

Sine Oculis Homeobox Homolog 1(SIX1)表達的增加導致PRIM1等上調，促進了宮頸癌細胞的增殖和生長[32]；PRIM1失活通過S期停滯和Wee1介導的caspase8依賴的凋亡，使結直腸癌細胞對磷脂酰肌醇3激酶相關激酶ATR和CHK1激酶抑制劑敏感[33]；PRIM1受到血清雌二醇(E2)誘導的ER激活轉錄調節，靶向PRIM1蛋白表達顯著降低ER+乳腺癌腫瘤細胞生長[9]。目前針對PRIM1的研究較少，其功能和作用機理有待進一步研究。

本研究中，我們闡述了PRIM1在多種類型癌中失調且在LIHC中高表達。基于臨床病例特征進行亞組分析表明，PRIM1對所有亞型和不同種族的LIHC診斷有用，其可能是潛在的診斷和預后標志物有待臨床驗證。癌癥進程伴隨著基因組變異，PRIM1基因組發生的遺傳改變，提示其可能在LIHC中具有潛在作用。對PRIM1相關的共表達基因進行GO和KEGG富集分析，有助于了解PRIM1在LIHC中參與的生物學過程和信號通路，為研究PRIM1在LIHC中的作用提供方向。分析預后因素有助于臨床治療的決策。研究表明，高表達PRIM1與較差的OS、PFS、RFS和DSS有關，可能是LIHC預后不良的預測指標，表明PRIM1表達水平可能是LIHC生存需要考慮的重要因素，值得進一步探究。我們的研究為理解PRIM1在LIHC中的潛在作用及其作為癌癥生物標志物的應用提供了新視角。