兩種豬偽狂犬gE抗體ELISA檢測試劑盒效果評價

陳瀅鍇　張紅云,2　彭小玉　陳海蘭　王金子　齊豫川

兩種豬偽狂犬gE抗體ELISA檢測試劑盒效果評價

陳瀅鍇1張紅云1,2彭小玉1陳海蘭1王金子2,3齊豫川4

（1.廣西大學，廣西 南寧 530005；2.廣西璞締恩葳生物技術有限公司，廣西 南寧 530007；3.廣西民族大學海洋與生物技術學院，廣西 南寧 530006；4.中國科技開發院廣西分院，廣西 南寧 530022）

目的：為了評估A、B兩種豬偽狂犬gE抗體ELISA檢測試劑盒的檢測效果，為豬偽狂犬gE抗體ELISA檢測試劑盒提供選擇依據。方法：試驗將12份待檢血清樣品進行檢測并計算A、B試劑盒的符合率和陽性率；通過對3份留樣血清樣品進行梯度稀釋、設置平行實驗進行檢測，評估兩種試劑盒的重復性、靈敏度和穩定性。結果：用兩種試劑盒檢測，樣品的陽性率均為33.3%，符合率為100%；通過稀釋留樣血清樣品的檢測和平行試驗發現：用A試劑盒檢測兩份樣品，檢出顯示陽性的最低稀釋度分別為1∶64和1∶16；用B試劑盒檢測2份樣品，檢出顯陽性的最低稀釋度分別為1∶32和1∶8。結論：兩種試劑盒重復性好，均適用于臨床樣品的PRV gE抗體檢測，但A試劑盒靈敏度高于B試劑盒，而B試劑盒穩定性更高且價格更低。說明生產實踐中應對A、B試劑盒的重復性、靈敏度、穩定性和價格因素進行綜合考量，合理選擇性價比更高試劑盒。

豬偽狂犬病；gE抗體；ELISA檢測；靈敏度比較

引言

偽狂犬病（pseudorabies，PR）是由偽狂犬病病毒（pseudorabies virus，PRV）感染豬、牛、羊等多種家畜和野生動物引起的一種高度接觸性傳染病。豬是該病毒的主要天然宿主、貯存者和傳播者[1,2]。豬被感染的典型臨床特征是妊娠階段的母豬出現流產，哺乳仔豬出現高熱、神經癥狀，仔豬流產率高、死亡率高[3]，育成階段的豬表現為體表皮膚瘙癢，出現疹塊危及到豬群的健康成長。偽狂犬病在全球養豬業普遍存在[4]，我國自1947年首次報道該病以來，已有20多個省（自治區、市）流行過該病，并在許多豬場呈暴發性流行[5]，偽狂犬病是現代養豬業要面對的主要病原之一，對生豬養殖業造成的經濟損失十分嚴重[6]。近年來，更有報道認為PRV可引起人眼內炎和腦炎[7-9]。這些發現表明PRV感染是一個潛在的公共衛生風險，不僅限于養豬業。因此，研究豬偽狂犬gE抗體ELISA檢測試劑盒的效果對豬偽狂犬病的檢測與凈化刻不容緩。陳偉杰、董雅琴等研究者曾對市場上的一些PR gE抗體檢測試劑盒進行了比較分析，給出了一定的建議。其中，陳偉杰等[10]側重于對不同試劑盒之間檢測結果的一致性進行評價，董雅琴等[11]側重于比較分析各試劑盒敏感性、特異性以及試驗結果的重復性與準確性。楊濤[1]、陸江[12]等均對進口試劑盒進行比較研究。段群棚[13]、宋詩川[5]等均采用進口試劑盒進行檢測。目前沒有研究對市場上廣泛使用的外國和國產品牌的檢測靈敏度、穩定性、符合率及價格等方面進行系統地比較分析，忽略了國產試劑盒的重要性。本研究從試劑盒的檢測靈敏度、穩定性、符合率及價格等方面進行比較分析，為養豬生產實踐中選擇更合理PRV gE抗體ELISA檢測試劑盒提供依據。

1　材料

1.1　血清樣品

南寧市某規模養殖場送檢的12份臨床背景清楚的待檢血清樣品和實驗室留樣保存的3份血清樣品。

1.2　試劑

A廠家生產的PRV gE 抗體試劑盒（批號為AT 069，阻斷ELISA），簡稱A試劑盒；B廠家生產的PRV gE 抗體試劑盒（批號為EP 0621017，阻斷ELISA），簡稱B試劑盒。

1.3　主要儀器

恒溫培養箱（型號為DHP-9162），購自上海齊欣科學儀器有限公司；酶標儀（型號為F50），購自帝肯（上海）貿易有限公司。

2　方法

2.1　試驗設計

2.1.1待檢血清樣品的檢測

將12份待檢血清按順序編號，按照試劑盒說明書要求分別用A、B兩種試劑盒進行檢測，計算其符合率（指A、B試劑盒檢測同一樣品同時定性為陽性或陰性數量之和除以檢測總數）和陽性率。

2.1.2留樣血清樣品的檢測

3份留樣血清樣品經梯度稀釋后用A、B試劑盒檢測，共設置平行實驗3次，對兩種試劑盒的重復性和靈敏度進行評估；對3份樣品不同稀釋度的3個結果（OD值）計算變異系數（CV=平均值/標準差），再計算每個樣品的平均變異系數，以衡量兩種試劑盒的穩定性。

2.2　結果判定

計算公式：S/N值＝樣品OD值/陰性對照OD值

A試劑盒判定標準：S/N值≤0.6為陽性，S/N值＞0.7為陰性，S/N值在0.6～0.7判為可疑。

B試劑盒判定標準：S/N值≤0.6為陽性，S/N值＞0.6為陰性。

3　結果與分析

3.1　待檢血清樣品的檢測結果

用A、B試劑盒對12份待檢血清樣品的gE抗體進行檢測，結果顯示樣品3、樣品6、樣品7、樣品8四份樣品均為陽性，其余樣品均為陰性，陽性率均為33.3%（見表1）；12份樣品中同時為陽性的樣品有4份，同時為陰性的樣品有8份，無可疑項，故兩種試劑盒的符合率為100%（見表2）。

表1　A、B試劑盒對待檢血清樣品的檢測結果

表2　A、B試劑盒對待檢血清樣品的檢測結果的符合率

3.2 留樣血清樣品的檢測結果

用A、B試劑盒檢測三份留樣血清樣品，結果均顯示樣品1、樣品3為陽性，樣品2為陰性（見表3至表4）。用A試劑盒檢測樣品1和樣品3，檢出顯示陽性的最低稀釋度分別為1∶64和1∶16；用B試劑盒檢測樣品1和樣品3，檢出顯陽性的最低稀釋度分別為1∶32和1∶8；（見圖1和圖3）故判斷A試劑盒檢測靈敏度更高，A、B試劑盒均能有效檢出樣品2為陰性（見圖2）。A、B試劑盒各稀釋度的平均變異系數都小于10%，說明其重復性良好，B試劑盒各稀釋度平均變異系數均小于A試劑盒，說明其重復性最好，穩定性最高（見圖4）。

表3　A試劑盒對留樣血清樣品的檢測結果（n=3）

注：S/N值取X±S，其中X為三次平行試驗S/N值的平均值；S為三次平行試驗S/N值的標準偏差。

表4　B試劑盒檢測結果（n=3）

注：S/N值取X±S，其中X為三次平行試驗S/N值的平均值；S為三次平行試驗S/N值的標準偏差。

圖1 樣品1檢測結果

注：S/N值低于0.6判定為陽性，下同。

圖2 樣品2檢測結果

圖3 樣品3檢測結果

圖4　留樣血清檢測結果的變異系數比較

4　討論

目前，國內基本上是通過PRV gE基因缺失疫苗配合gE-ELISA檢測試劑盒來剔除野毒感染豬，并加強豬場生物安全措施、引種監測、嚴防新毒株的傳入，開展豬偽狂犬病的控制與凈化工作[14]。gE基因是PRV的非必需基因，PRV缺失gE基因后，病毒毒力降低，但不會影響病毒的復制擴增和免疫原性[15]，因此gE基因是PRV一個良好的標記基因，目前市面上廣泛使用的PRV疫苗，就是利用這個原理，缺失了gE基因降低了PRV的病毒毒力，但保留了原毒株的免疫原性[16,17]，因此在疫苗免疫后檢測不到gE抗體；而PRV所有野毒株有gE基因，在被PRV野毒感染的豬體內能檢測到gE蛋白，這為利用分子生物學和血清學方法進行PRV 野毒感染和gE基因缺失疫苗鑒別診斷提供了條件[18]。國內大多豬場只使用gE基因缺失的偽狂犬疫苗，故利用gE抗體檢測來區分養殖場是否被PRV野毒感染。

當前PR的傳播給國內養豬業造成了巨大的經濟損失，而對PR野毒的及時檢出，是豬場制定有效治療和防控措施的關鍵。由于PRV gE基因缺失疫苗被廣泛應用，通過對豬血清中PRV gE抗體的檢測，可判斷豬場是否存在野毒感染。此方法也是目前豬場進行PR診斷和凈化重要且有效的手段。目前檢測gE蛋白特異性抗體的方法主要有病毒中和試驗（VNT）、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）、乳膠凝集試驗（LAT）。其中，VNT因不適宜于大面積的臨床診斷與篩查而難以在實際生產中[19,20]；LAT具有較高的可靠性，但其較復雜的操作方法也限制了它的廣泛應用[21]。生豬養殖場普遍采用的是基于阻斷ELISA原理的gE蛋白特異性抗體檢測試劑盒，具有操作簡單、通量高等優勢，備受臨床從業人員的青睞[22]。但各廠家的試劑盒在質量和價格上存在較大差異，因此，如何選擇準確的診斷試劑盒是目前普遍存在的問題。

本試驗通過對12份待檢血清樣品和3份留樣血清樣品的全面檢測，發現兩種試劑盒對待檢血清樣品的檢出率均為33.3%，符合率為100%，均適用于臨床樣品的PRV gE抗體檢測。但是通過稀釋留樣血清樣品的檢測和平行試驗發現，A試劑盒的靈敏度高于B試劑盒，但B試劑盒穩定性更高且價格更低。此外，本試驗A試劑盒符合率與楊濤等[1]結果相似，與其他廠家生產的試劑盒相比有較高的符合率，gE抗體陽性率33.3%與段群棚等[13]的檢測結果相符；比宋詩川檢測結果偏高，可能是本試驗樣品數量較少或與豬場間PRV防控水平差異相關，也可能是與gE抗體陽性率呈上升趨勢有關[5]。陸江等[12]直接將A試劑盒的檢測數據作為標準，評價其他廠家的試劑盒，表現出A試劑盒具有良好的檢測效果。B試劑盒檢測結果與董雅琴等的數據有所差別，可能是不同批次間重復性較差[11]。

5 結論

綜上所述，A、B試劑盒檢測結果高度一致，均可應用于臨床檢測。而A試劑盒是經過我國農業部注冊的PRV進口診斷產品，靈敏度更高，同時其操作方法也列入了農業部的行業標準，質量經過了嚴格的檢驗，在國內和國際上都被高度認可；B試劑盒為常用國產診斷產品，在試劑盒成本上更具優勢，且穩定性更佳，若要對PRV野毒抗體進行持續監測，就需試劑盒具備較好的穩定性，以保證監測數據的可靠性，這時應選擇B試劑盒。若用于PR凈化則建議使用靈敏度較高的A試劑盒，但A試劑盒成本更高，臨床檢測需綜合考量。

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Effect Evaluation of Two ELISA Kits for Detecting gE Antibody in Swine Pseudorabies

Objective: To evaluate the detection effect of ELISA kit for gE antibody of swine pseudorabies A and B, and to provide a basis for selection of ELISA kit for gE antibody of swine pseudorabies. Methods: 12 serum samples were tested and the coincidence rate and positive rate of kit A and B were calculated; the repeatability, sensitivity and stability of the two kits were evaluated by gradient dilution of 3 retention serum samples and parallel test. Results: The positive rate of samples was 33.3% and the coincidence rate was 100% when tested with two kinds of kits; through the detection of diluted serum samples and parallel test, it was found that the lowest dilution of positive results were 1∶64 and 1∶16 respectively when two samples were detected with kit A; two samples were tested with kit B, and the minimum dilution of positive reaction was 1∶32 and 1∶8, respectively. Conclusion: The two kits have good repeatability and are suitable for the detection of PRV gE antibody in clinical samples. However, the sensitivity of kit A is higher than that of kit B, while kit B has higher stability and lower price. It indicates that the repeatability, sensitivity, stability and price factors of A and B reagent kits should be comprehensively considered in production practice, and a more cost-effective kit should be reasonably selected.

swine pseudorabies; gE antibody; ELISA test; sensitivity comparison

S828

A

1008-1151(2022)12-0039-04

2022-09-23

南寧市優秀青年科技創新創業人才培育項目（RC20190102）。

陳瀅鍇（1998－），男，四川宜賓人，廣西大學在讀碩士研究生，研究方向為動物疾病快速檢測。

王金子（1982－），男，黑龍江齊齊哈爾人，廣西民族大學海洋與生物技術學院副教授，博士，碩士生導師，研究方向為微生物資源利用；齊豫川（1991－），男，河南鄭州人，中國科技開發院廣西分院工程師，碩士，研究方向為分子生物學。