2型糖尿病患者皮膚晚期糖基化終末產物和血清肌肽酶-1與糖尿病微血管并發癥的關系研究

楊光，徐新，張宇，許娟，蔣淑娟，夏莉，張洋，王貽坤，李忠勝，章詩琪*

隨著全球糖尿病發病率的穩步上升，預計糖尿病嚴重并發癥的發病率及其相關的醫療支出將同步增加。大多數糖尿病患者在病程中至少會出現1種并發癥。糖尿病腎病（DN）和糖尿病視網膜病變（DR）是糖尿病最常見的并發癥，且是終末期腎病（ESRD）和失明的主要原因［1］，這些并發癥的發生、發展機制尚未完全明確。

活性羰基（RCS）和活性氧（ROS）在晚期糖基化終末產物（AGEs）和脂氧化終末產物（ALEs）的形成中起著重要作用。正常生理條件下AGEs的生成量很低，隨著年齡的增長AGEs在血清、皮膚、軟骨和心包液中不斷積累［2］。一些與年齡有關的疾病如神經退行性疾病和冠心病，已被證明與AGEs有關［3-5］。一種糖基化活性氧即甲基乙二醛（MGO）的形成加速了高血糖患者中AGEs的形成，這些患者組織中增加的AGEs和ALEs被認為是糖尿病并發癥的關鍵遞質［6-8］。多項研究表明AGEs可導致細胞外基質堆積、慢性炎癥和細胞增殖受損［9-10］。

L-肌肽是一種具有多種生化特性的二肽，可在糖化或氧化應激環境下起組織保護作用［11］。一般情況下肌肽可以滅活活性羰基，減少AGEs的形成，此外還可以作為抗氧化劑減少氧化應激和脂質過氧化。在人體內，循環中的L-肌肽很容易被血清肌肽酶-1（CN-1）降解。血清CN-1活性和濃度在個體間差異很大，但總體上女性高于男性［12-13］。由于L-肌肽的保護作用，低水平的CN-1可能有利于組織中高濃度肌肽的維持，從而對糖化和/或氧化性組織損傷有更好的保護作用。

測量皮膚AGEs水平的金標準是皮膚活檢后的生化測定，但皮膚自體熒光（SAF）作為一種非侵入性的、實用的評估皮膚AGEs水平的替代方法越來越受到重視［14-15］。研究顯示，糖尿病患者和DN患者的皮膚AGEs水平升高，且與心血管疾病（CVD）有關，而與已知的心血管疾病危險因素無關［16-18］。目前為止，2型糖尿病患者組織中AGEs與血清CN-1濃度之間的相關性仍不清楚，本研究試圖評估這種相關性是否存在以及AGEs和血清CN-1濃度與部分糖尿病微血管并發癥〔DN、DR、糖尿病周圍神經病變（DPN）及糖尿病周圍血管病變〕的關系。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2021年1—3月在安徽醫科大學第一附屬醫院內分泌科住院的2型糖尿病患者134例為研究對象。納入標準：年齡＞18歲。2型糖尿病的診斷參考WHO 1999年糖尿病的診斷標準，即：存在糖尿病癥狀（典型癥狀為多尿、多飲、多食和體質量減輕）且隨機血糖≥11.1 mmol/L或空腹血糖≥7.0 mmol/L或口服葡萄糖耐量試驗（OGTT）2 h血糖≥11.1 mmol/L，若無典型癥狀需再測空腹血糖和OGTT 2 h血糖1次予證實。排除標準：嚴重腎臟、心臟、肝臟疾病；惡性腫瘤；尿路感染或發熱。本研究方案得到了安徽醫科大學第一附屬醫院臨床醫學研究倫理委員會的批準（編號：PJ2020-15-17），患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 一般資料收集 收集患者的性別、年齡、身高、體質量、糖尿病病程、收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP），并計算體質指數（BMI）=體質量（kg）/身高2（m2）

1.2.2 糖尿病微血管并發癥及其他疾病發生情況收集DR：免散瞳眼底鏡檢查顯示視網膜微血管瘤、出血、硬性滲出、軟性滲出、視網膜新生血管等DR的特征性改變。

DN： 估 算 腎 小 球 濾 過 率（eGFR）＜60 ml·min-1·（1.73 m2）-1和 /或尿白蛋白 /肌酐比值（ACR）＞30 mg/g，持續超過3個月。ACR參考范圍為＜30 mg/g，微量白蛋白尿和大量白蛋白尿分別為30≤ACR＜300 mg/g和ACR≥300 mg/g。

DPN：在排除其他原因的情況下，糖尿病患者出現周圍神經功能障礙相關的癥狀和/或體征，并使用肌電圖（JB-904BK，Nihon Kohden，日本）檢查正中神經/尺神經/橈神經/腓神經傳導速度以診斷DPN。

本研究糖尿病周圍血管病變是指存在全身動脈粥樣硬化，即血管彩超提示動脈中出現血栓以及斑塊時部分患者可能會存在管腔狹窄、閉塞并導致遠端肢體缺血，使用彩色多普勒超聲（Xario 100，Toshiba日本）檢測并確診。

高血壓：基于病歷或在住院期間未使用降壓藥物非同日3次診室收縮壓≥140 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）和/或舒張壓≥90 mm Hg。

血脂異常：在正常飲食情況下，滿足下列4項中任意1項，（1）總膽固醇（TC）≥5.18 mmol/L；（2）三酰甘油（TG）≥1.70 mmol/L；（3）高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）＜1.04 mmol/L；（4）低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）≥3.37 mmol/L。

卒中、冠心病發生情況根據既往醫療記錄進行確定。

1.2.3 實驗室檢查指標收集 采用化學發光法檢測空腹C肽（FC-P），采用全自動尿液分析儀檢測ACR，采用高效液相法檢測糖化血紅蛋白（HbA1c），采用腎臟病飲食改良（MDRD）公式計算eGFR。

1.2.4 皮膚AGEs測定 由經過培訓的護士使用DM Scan（AGEs無創檢測系統，中國科學院合肥物質科學研究院研制）于患者左前臂掌側的皮膚進行自體熒光檢測以評估皮膚AGEs［19］，該裝置使用近似紫外光（中心波長：370 nm，半高寬：15 nm） 照射皮膚并刺激皮膚AGEs的釋放（波長范圍420～600 nm），同時該裝置在420～600 nm的波長范圍內發射寬帶光源照射皮膚以測量組織的光照吸收和散射。通過3×1光纖束在300～600 nm的波長范圍內采用光譜儀測量皮膚的發射光，包括漫反射光和熒光。熒光強度與漫反射光強度的比值為最終記錄的皮膚AGEs。所有測量在室溫、黑暗環境中進行，沒有可見的血管、瘢痕、皮癬形成或其他皮膚異常的正常皮膚上進行。每位患者的皮膚AGEs重復測量3次，取均值記錄。

1.2.5 血清CN-1測定 患者入院第2天留取空腹靜脈血5 ml，離心后取血清，采用ELISA試劑盒（CUSABIO，武漢，中國）測定血清CN-1水平。

1.3 觀察指標 分析皮膚AGEs與血清CN-1的相關性，皮膚AGEs、血清CN-1與一般資料、糖尿病微血管并發癥及其他疾病、實驗室檢查指標的相關性，探究皮膚AGEs、血清CN-1變化的影響因素。

1.4 統計學方法 采用SPSS 16.0軟件進行統計學分析。符合正態分布的計量資料以（±s）表示，不符合正態分布的計量資料采用M（P25，P75）表示，計數資料以相對數表示；連續變量之間的相關性采用Pearson相關分析和Spearman秩相關分析；皮膚AGEs和血清CN-1的影響因素分析采用多元線性回歸分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況 134例患者中女57例，男77例；平均年齡（53.8±12.3）歲；平均BMI（25.3±4.2）kg/m2；平均糖尿病病程6.5（2.0，10.0）年；SBP（139.2±20.5）mm Hg，DBP （79.0±12.5）mm Hg。DR 13 例（9.7%），DN 38例（28.4%），DPN 56例（41.8%），糖尿病周圍血管病變79例（59.0%），高血壓61例（45.5%），血脂異常56例（41.8%），腦卒中15例（11.2%），冠心病9例（6.7%）。DN中ACR處于參考范圍2例（1.5%），微量白蛋白尿26例（19.4%），大量白蛋白尿10例（7.5%）。

FC-P 0.9（0.6，1.4）μg/L，ACR 13.4（7.0，37.4）mg/g，HbA1c（9.1±2.5）%，eGFR（103.9±26.2）ml·min-1·（1.73 m2）-1。皮膚 AGEs（80.2±10.6），血清CN-1（6.9±3.4）μg/L。

2.2 各項指標與皮膚AGEs的相關性分析 相關性分析結果顯示，性別、年齡、DR與皮膚AGEs呈正相關（P＜0.05），eGFR、CN-1與皮膚AGEs呈負相關（P＜0.05），其余指標與皮膚AGEs無相關關系（P＞0.05），見表1。

2.3 皮膚AGEs影響因素的多元線性回歸分析 以皮膚AGEs為因變量（賦值：實測值），以表1中差異有統計學意義的變量為自變量（賦值見表2）進行多元線性回歸分析，結果顯示性別、年齡、DR是皮膚AGEs的影響因素（P＜0.05），見表3。

表1 各項指標與皮膚AGEs的相關性分析Table 1 Correlation analysis of clinical variables with skin AGEs in type 2 diabetes

表2 皮膚AGEs/血清CN-1影響因素的多元線性回歸分析賦值Table 2 Assignment of factors potentially associated with skin AGEs and serum CN-1 in type 2 diabetes in multiple linear regression analysis

表3 皮膚AGEs影響因素的多元線性回歸分析Table 3 Multiple linear regression analysis of factors potentially associated with skin AGEs in type 2 diabetes

2.4 各項指標與血清CN-1的相關性分析 相關性分析結果顯示，年齡、DBP與血清CN-1呈正相關（P＜0.05），皮膚AGEs與血清CN-1呈負相關（P＜0.05），其余指標與血清CN-1無相關關系（P＞0.05），見表4。

2.5 血清CN-1影響因素的多元線性回歸分析 以血清CN-1為因變量，以表4中差異有統計學意義的變量為自變量（賦值均為實測值）進行多元線性回歸分析，結果顯示年齡、DBP、皮膚AGEs均不是血清CN-1的影響因素（P＞0.05），見表5。

表4 各項指標與血清CN-1的相關性分析Table 4 Correlation analysis of clinical variables with serum CN-1 in type 2 diabetes

表5 血清CN-1影響因素的多元線性回歸分析Table 5 Multiple linear regression analysis of factors potentially associated with serum CN-1 in type 2 diabetes

3 討論

近年來大量研究顯示AGEs參與糖尿病慢性并發癥的發生、發展［6-10］。由于肌肽的親核作用可以清除活性羰基從而防止AGEs的形成，因此組織中肌肽的濃度對于減輕糖尿病并發癥可能是至關重要的。組織中肌肽濃度與多種因素相關，如組織中是否存在肌肽合成酶以及血清中肌肽水解酶CN-1的濃度和活性。本研究試圖評估皮膚AGEs和血清CN-1水平之間是否存在相關性以及其與糖尿病微血管并發癥的潛在關系。

本研究結果顯示，性別、年齡、DR與皮膚AGEs呈正相關，eGFR、CN-1與皮膚AGEs呈負相關；多元線性回歸分析結果顯示，性別、年齡、DR是皮膚AGEs的影響因素。皮膚AGEs與年齡關系的既往研究結果顯示，AGEs與年齡相關的疾病之間存在正相關［20］，本研究結果與之相似，這可能是由于衰老導致機體內氧化代謝產物堆積，從而促進AGEs生成增加，也可能是AGEs本身即可促進衰老有關［21］。在皮膚AGEs與DR的體內［22］和體外［23］研究中，皮膚AGEs和DR之間的關系已經得到證實。此外皮膚活檢［24］或SAF［25］測量的AGEs已被認可為診斷DR的標準。AGEs可能是通過引發內皮功能障礙、促進促炎細胞因子和促血管生成因子形成、介導周細胞凋亡，進而使視網膜的神經和血管發生損傷，促進DR的發生、發展。目前，新型抗AGEs藥物正在研究中，如肌肽、氨基胍、吡哆胺和苯基噻唑溴化物等，動物實驗已經證實肌肽能夠緩解糖尿病大鼠的DR［26］，但此類藥物應用于臨床則有待于未來進一步的研究。

有研究顯示，皮膚AGEs與DN、DPN存在一定關系［24-25］，但本研究未發現皮膚AGEs與DN之間的聯系。在相關性分析中，皮膚AGEs與ACR之間的P值為0.262，其原因可能為本研究中微量白蛋白尿或大量蛋白尿患者所占比例相對較小。本研究未發現皮膚AGEs與DPN存在相關關系，與YOSHIOKA［26］研究結果不同，這可能是由于用來定義DPN的標準不同。本研究中DPN是根據肌電圖結果來確定的，而在YOSHIOKA［26］的研究中是根據神經病變癥狀來診斷，后者更傾向于感覺神經病變，而肌電圖則覆蓋感覺和運動神經病變。AGEs在不同神經病變之間是否作用不同則有待于進一步研究證實。

既往有關血清CN-1與糖尿病微血管并發癥的研究顯示，在2型糖尿病和腎功能受損的高加索人種患者中，血清CN-1濃度隨著蛋白尿的增加而降低［27-28］。本研究未發現血清CN-1與ACR相關，亦未發現血清CN-1與其他糖尿病微血管并發癥的關系，盡管已有研究表明肌肽在鏈脲佐菌素（STZ）誘導的DR［26］和DPN［29］模型中有保護作用，這一方面可能與人群不同有關，一方面可能與本文樣本量較小有關，后期有待中國人群的大樣本試驗進一步研究。此外，本研究使用的是CUSABIO試劑盒測量血清CN-1，既往有研究使用RYSK-ELISA和ATLAS-ELISA方法測量血清CN-1［30］，不同的ELISA系統可能使用不同的CN-1抗體，使得血清CN-1測量值有所差異，這也需要進一步研究進行鑒別。

綜上所述，皮膚AGEs、血清CN-1濃度與大部分糖尿病微血管并發癥間無明顯相關關系，但皮膚AGEs與糖尿病微血管并發癥特別是DR的相關性大，因此皮膚AGEs更值得臨床關注和進一步研究。

作者貢獻：楊光、章詩琪提出研究構思與設計；夏莉、章詩琪進行研究指導；徐新、張宇、許娟、蔣淑娟、張洋、王貽坤、李忠勝參與數據收集、整理；楊光進行統計分析及撰寫論文；章詩琪進行論文修訂，負責文章的質量控制及審校，對文章整體負責、監督管理。

本文無利益沖突。