一株羅非魚源甲基營養型芽孢桿菌的分離鑒定

■ 文｜深圳市漁業發展研究中心 黃浦江 徐遠珍

羅非魚原產于非洲，包括亞種在內共計100多種。羅非魚肉質鮮美，無間刺，蛋白含量高，富含8種人體所需的必需氨基酸、不飽和脂肪酸等，素有“白肉三文魚”之稱。同時，因其具有生長快、食性雜、耐低氧、繁殖能力強等特點，被評定為最具發展潛力的淡水特色優勢品種。

甲基營養型芽孢桿菌抗菌肽在生物保鮮劑上具有廣闊的應用前景，甲基營養型芽孢桿菌產生的抗菌肽可使羅非魚片保質期延長4d以上。甲基營養型芽孢桿菌的抑菌代謝產物常見有：抑菌蛋白、蛋白酶、纖維素酶、氨肽酶、抑菌肽等，甲基營養型芽孢桿菌在細菌病的治療和食物保鮮上具有廣闊的前景。本研究使用的甲基營養型芽孢桿菌采自于深圳某羅非魚養殖場羅非魚腸道，研究人員對其進行了革蘭氏染色、16S rRNA鑒定及生化鑒定，旨在為今后篩選提高羅非魚抗病能力、促進羅非魚健康生長的甲基營養型芽孢桿菌提供理論依據，從而為研發甲基營養型芽孢桿菌在羅非魚及其他經濟水產動物養殖上的應用提供參考。

材料與方法

1.甲基營養型芽孢桿菌分離純化

本次使用的羅非魚（200±50）g置于超凈工作臺中，用75%的酒精棉球擦拭魚體表面，解剖取出腸道。用無菌生理鹽水沖洗數遍，清除腸道內容物，置于玻璃勻漿器中加入1mL生理鹽水進行研磨，研磨充分后用三倍無菌生理鹽水連續稀釋，用渦旋攪拌機混勻，分別涂布于TSA、MRS、TPY、PDA平板上，每個平板涂布100μL，各種平板設置6個重復，其中3個置于30℃無氧條件中培養，另外3個置于30℃有氧條件中培養。48h后挑取單個菌落，反復劃線分離至獲得純菌株。通過革蘭氏染色、鏡檢，初步篩選出革蘭氏陽性桿菌。

2.甲基營養型芽孢桿菌的鑒定

挑取上述從羅非魚腸道分離出的革蘭氏陽性菌株，提取其DNA，送公司測序。利用NCBI的Blast程序比對分析16S rRNA基因序列測序結果。利用最大簡約法和鄰接法進行分析，用MEGA6軟件構建系統發育樹，重復次數為1000。

3.生化鑒定

菌株的生化鑒定主要通過HBI蠟樣芽孢桿菌生化鑒定條和單盒生化鑒定管來鑒定。鑒定方法遵照鑒定條（管）使用說明書中的方法，在超凈工作臺上操作，用酒精棉球擦拭鑒定條（管），鑒定條用打孔器打孔，鑒定管用鑷子打開鋁蓋，注入100μL菌懸液，封蓋培養，培養條件、時間及結果判定參照說明書。

結果與分析

1.甲基營養型芽孢桿菌的分離

從羅非魚腸道中分離出1株甲基營養型芽孢桿菌，命名為TPS-A。分離得到的菌株革蘭氏染色為陽性，顯微鏡下觀察為桿狀（圖1）。

圖1 菌株TPS-A革蘭氏染色圖

2.甲基營養型芽孢桿菌的鑒定

采用16sRNA PCR技術對該菌株進行鑒定。經廣州生工生物技術有限公司測序證實，菌株TPS-A的DNA bp值為1454（圖2），基因庫編號為MK130896。

圖2 泳道M：DNA marker DL 2000泳道1：TPS-A PCR 產物

系統發育分析表明（圖3），菌株TPS-A與B.methylotrophicus strain CBMB205、B.velezensis strain FZB42、B.siamensis strain PD-A10的相似性分別為99.79%、98.26%、95.34%，與B.methylotrophicus strain一類物種的親緣關系最高且聚為一支，所以推薦鑒定該菌種為B.methylotrophicus strain。

圖3 基于TPS-A 16S rRNA 基因序列構建的系統發育樹

3.生化鑒定結果

根據生化鑒定條（管）說明書提供的判定標準，得出菌株TPS-A的生理生化特性如表1。菌株TPS-A，淀粉水解試驗、硝酸鹽肉湯試驗等試驗均為陽性，溶酶菌肉湯試驗、VP試驗、甲基紅試驗、精氨酸雙水解酶試驗等試驗均為陰性，糖發酵結果為，菌株TPS-A可以發酵葡萄糖，不能發酵肌醇等。

表1 羅非魚腸道分離芽孢桿菌TPS-A 的生化鑒定結果

結論

本次研究通過平板劃線分離、革蘭氏染色、鏡檢、16S rRNA以及生理生化鑒定等方法，成功從羅非魚腸道中分離得到了一株甲基營養型芽孢桿菌，因其不具有常用抗生素耐藥性基因，使得這菌株在耐藥性基因產生、轉移等相關研究中具有廣闊的前景，也能為羅非魚源甲基營養型芽孢桿菌的篩選、鑒定、分析和應用提供參考。