GO-CoA-Tat對非酒精性脂肪性肝病小鼠的肝損傷保護作用

張紹仁 胡靜嫻 周皓 蔣淼 樊曉明

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)發病機制復雜，可能與肥胖癥和2型糖尿病等代謝紊亂密切相關，目前尚無有效治療方法[1-5]。饑餓素O-酰基轉移酶(ghrelin o-acyltransferase, GOAT)是饑餓素(Ghrelin)特異的酰基化轉移酶[6, 7]。有研究提示GOAT-Ghrelin在能量代謝、脂質代謝等環節發揮重要調節作用[8, 9]。GOAT拮抗劑GO-CoA-Tat是一種基于多肽的雙底物類似物，腹腔注射可改善小鼠血葡萄糖耐量及減少食物攝入[10-12]。GO-CoA-Tat能否調節肝臟脂質代謝尚不清楚。本研究探索GO-CoA-Tat對小鼠肝臟脂肪變性和脂肪性肝炎相關炎癥指標的作用。

材料與方法

一、動物飼養和處理方案

雄性C57bl/6小鼠18只，8～10周齡，體質量(23.0±2.0)g，購自上海靈昌生物科技有限公司。高脂飲食(high fat diet, HFD)飼料(D12492，上海睿安生物有限公司)用于誘導小鼠肥胖及脂肪肝。小鼠在23℃環境下標準方法飼喂，隨機分成3組，每組6只。正常組：給予小鼠正常飲食。HFD+Saline組：小鼠HFD喂養8周，每周1次腹腔注射0.9% NaCl溶液。HFD+GO-CoA-Tat組：小鼠HFD喂養8周，每周1次腹腔注射GO-CoA-Tat 96 μg/kg。所有小鼠在第8周處死，采集肝臟樣本和血液進行組織學和血清學分析。

二、生化檢測

微孔板檢測試劑盒(上海閃譜生物公司)測定血清ALT、AST、TG、TC和GLU水平。細胞脂質測定試劑盒(上海閃譜生物公司)檢測小鼠肝臟三酰甘油濃度。

三、實時定量反轉錄聚合酶鏈反應

分離總RNA，SYBR Green PCR依據生產商的操作流程進行。總RNA提取采用TRIzol試劑盒。使用7900HT Fast Real-Time PCR系統(Applied Biosystems，美國)進行SYBR Green定量RT-PCR，依據SYBR Premix EX Taq(TaKaRa生物公司)操作介紹確定靶基因表達，引物序列GAPDH：上游5′-TATGTCGTGGAGTCTACTGGT-3′；下游5′-GAG-TTGTCATATTTCTCGTGG-3′，產物長度149 bp。TNF-α：上游5′-CACCACTTCGAAACCTGGGA-3′；下游5′-TGTAGGCCCCAGTGAGTTCT-3′，產物長度105 bp。IL-6：上游5′-TCAATATTAGAGTCTC-AACCCCCA-3′；下游5′-TTCTCTTTCGTTCCCG-GTGG-3′，產物長度90 bp。

四、統計學方法

結 果

一、3組小鼠體質量和血糖水平比較

喂養第8周末，小鼠體質量HFD+Saline組為(37.327±0.296)g，正常組為(31.765±0.235)g，HFD+GO-CoA-Tat組(33.125±0.153)g，差異有統計學意義(F=26.43，P=0.009)。在喂養第8周末檢測各組小鼠空腹血糖水平，HFD+Saline組為(6.370±0.296)mmol/L，正常組為(2.867±0.299)mmol/L，HFD+GO-CoA-Tat組為(4.103±0.184)mmol/L，差異有統計學意義(F=44.96，P=0.021)。組間兩兩比較，差異均有統計學意義(均P<0.05)。

二、3組小鼠肝細胞內和血脂水平比較

各組小鼠肝細胞內三酰甘油水平，HFD+Saline組為(101.332±2.052)mmol/L，正常組為(54.373±0.9694)mmol/L，HFD+GO-CoA-Tat組為(75.602±1.487)mmol/L，差異有統計學意義(F=224.7，P=0.023)。HFD+Saline組TG及TC分別為(1.943±0.136)、(5.013±0.369)mmol/L，正常組分別為(0.660±0.709)、(1.763±0.293)mmol/L，HFD+GO-CoA-Tat組分別為(1.237±0.071)、(2.403±0.151)mmol/L，差異均有統計學意義(F值分別為43.30和36.29，P值分別為0.023和0.031)。組間兩兩比較差異均有統計學意義(均P<0.05)。

三、3組小鼠炎性指標比較

HFD+Saline組ALT及AST分別為(54.901±5.201)、(173.321±13.971)U/L，正常組分別為(27.914±2.401)、(96.473±3.491)U/L，HFD+GO-CoA-Tat組分別為(37.862±2.425)、(122.932±6.907)U/L，差異均有統計學意義(F值分別為14.44和17.91，P值分別為0.029和0.015)。HFD+Saline組TNF-α和IL-6分別為(2.740±0.140)、(2.980±0.070)，正常組分別為(1.000±0.070)、(1.000±0.040)，HFD+GO-CoA-Tat組分別為(1.730±0.040)、(1.630±0.040)，差異均有統計學意義(F值分別為89.12和68.34，P值分別為0.021和0.034)。組間兩兩比較差異均有統計學意義(均P<0.05)。

討 論

NAFLD發病機制目前仍不明確，可能與冠心病的危險因素密切相關，如血脂異常、糖尿病和代謝綜合征等[13, 14]。

肥胖癥和糖耐量異常在NAFLD的發病機制中起著關鍵作用。“多重打擊”學說認為初次打擊為糖耐量異常，導致肝細胞內大量脂肪聚集，引起肝細胞脂肪變性[15, 16]。本研究發現，腹腔內注射GO-CoA-Tat可降低HFD小鼠的體質量增加并維持血糖穩定。GO-CoA-Tat能顯著抑制肝細胞及小鼠體內GOAT表達，在野生型小鼠中GO-CoA-Tat能控制體質量增加、改善血糖水平和調節食欲[10]。本研究結果顯示，GO-CoA-Tat能顯著緩解小鼠肝臟脂肪變性，并能減少肝細胞內脂質積聚。HFD+GO-CoA-Tat組TG及TC較HFD+Saline組有明顯下降，提示GO-CoA-Tat能有效降低小鼠血脂濃度。Ghrelin-GOAT系統可能胰島素抵抗、脂代謝調節過程發揮作用，而后兩者均參與了NAFLD病理的發生及進展[8, 9]。本研究顯示GO-CoA-Tat可能在減輕NAFLD的脂肪變性以及改善血糖方面發揮作用。

炎癥性肝損傷是非酒精性肝脂肪變向非酒精性脂肪性肝炎進展的重要因素。肝細胞內大量脂肪聚集，導致氧化應激、炎癥因子激活及肝細胞線粒體障礙，從而導致肝細胞炎癥、纖維化等發生[17]。GO-CoA-Tat干預后HFD小鼠血清肝功能指標水平有效降低，表明GO-CoA-Tat可緩解小鼠肝臟炎癥損傷，其作用可能源于潛在的對肝臟直接抗炎作用以及改善高脂肪飲食所致的代謝異常。

總之，GO-CoA-Tat可減輕小鼠的肝脂肪變性及炎癥反應，為將來更進一步的藥理學研究和治療藥物提供更多選擇。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。