POI患者雌激素水平與外周血T淋巴細胞亞群及PD-1的相關性

王榮慧，白 云，王海青

(1.山西醫科大學，山西 太原 030001；2.山西省婦幼保健院/山西省兒童醫院，山西 太原 030001)

早發性卵巢功能不全(primary ovarian insufficiency，POI)是指女性40歲之前出現卵巢功能減退，主要表現為月經異常(閉經、月經稀發或頻發)，血清促卵泡激素(follicle stimulating hormone，FSH)和黃體生成素(luteinizing hormone，LH)的濃度升高及雌二醇(estradiol，E2)水平波動性下降，并伴隨月經稀發及閉經癥狀[1]。POI在一般人群發病率為1%～5%[2]。隨著社會經濟的迅猛發展，女性社會精神壓力增大、生育時間推后及環境等因素的綜合影響，POI的發病率呈現出上升趨勢且主要集中于高知識群體[3]。POI患者病情繼續進展，即發展為卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)，POF是其終末階段。目前發病機制尚不明確，可造成患者全身多系統疾病。因此，POI及POF的研究受到越來越多的臨床關注。程序性死亡受體1(programmed-death-1，PD-1)表達于T淋巴細胞表面，是免疫抑制分子之一，當T淋巴細胞增殖、活化后，細胞表面PD-1表達量增加，并產生負向刺激信號，使得T淋巴細胞發生凋亡，功能受到抑制。本文對POI患者外周血雌二醇(E2)水平與CD4+、CD8+T淋巴細胞亞群表達量變化及PD-1表達的相關性進行研究，探討雌激素水平變化與T淋巴細胞免疫功能的相關性。

1研究對象與方法

1.1研究對象

選取2019年12月至2021年1月就診于山西省婦幼保健院門診的POI患者20例為研究組，選取同期孕前健康體檢婦女30例為對照組，所有研究對象的年齡為28～40歲。納入標準：對照組婦女為月經周期規律、無高雄激素血癥的臨床表現及多囊卵巢樣改變、無自身免疫性疾病及復發性流產史，血清FSH/LH和催乳素(prolactin，PRL)檢查無異常，超聲檢測有正常排卵的育齡期女性；研究組患者為自然月經周期狀態下，停經6個月或3個周期以上，FSH>25IU/L至少2次，間隔>4周，超聲檢查雙側卵巢體積小，雙側卵巢無10mm以上卵泡。排除標準：無肝腎疾病，無免疫系統或內分泌系統疾病，無惡性腫瘤及放化療病史，無婦科及卵巢手術史，近3個月內未使用過激素類藥物，2周內無感染性疾病病史。所有研究對象均知情同意，自愿完成本研究。

1.2臨床資料的收集

收集資料包括：研究對象的年齡、基礎疾病、婦產科病史、腫瘤病史、手術史、放化療病史及藥物使用情況。

1.3方法

1.3.1主要試劑

FITC-anti-human CD4熒光素標記單抗、PE-anti-human CD8熒光素標記單抗、PerCP/Cyanine5.5-anti-human PD-1熒光素標記單抗、PE/Cyanine5.5-anti-human CD45熒光素標記單抗(單克隆抗體均購自Biolegend公司)、溶血劑，性激素及甲狀腺功能試劑盒。

1.3.2主要儀器

流式細胞儀貝克曼FC500型、Cobas e601電化學發光免疫分析儀、CentaurXP全自動化學發光免疫分析儀。

1.3.3外周血樣本的采集和制備

外周血樣本采集時，于清晨8時抽取空腹靜脈血2管，各3mL，用EDTA抗凝。所有研究對象均需空腹8h以上，對照組于月經周期第3天采靜脈血，研究組可隨時采靜脈血。抽血后立即進行檢測，每個樣本取50μL全血，加入CD4/CD8/PD-1/CD45，單抗均加入20μL，混勻后避光孵育15min，加入500μL溶血劑，振蕩混勻，室溫避光孵育15min，加入1mL生理鹽水振蕩混勻，以1 500r/min離心5min，棄上清，加入PBS重懸細胞，上機測定。性激素的檢測采用Cobas e601電化學發光免疫分析儀(德國羅氏診斷有限公司)，使用上海羅氏診斷有限公司提供的試劑。甲狀腺功能的檢測采用CentaurXP全自動化學發光免疫分析儀(美國西門子醫學診斷股份有限公司)，使用美國西門子醫學診斷股份有限公司提供的試劑。血清抗繆勒管激素(anti-mullerian hormone，AMH)水平檢測由太原金域臨床檢驗所輔助完成。

1.4統計學方法

2結果

2.1兩組T淋巴細胞亞群檢測情況

對照組的CD4+和CD8+T淋巴細胞亞群百分比與研究組比較差異均有統計學意義(P<0.05)；兩組的CD4+/CD8+差異無統計學意義(P>0.05)；研究組的CD4+PD-1+和CD8+PD-1+表達量均顯著低于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1、圖1。

表1 外周血T淋巴細胞亞群及PD-1檢測結果的比較Table 1 Comparison of T lymphocyte subsets and PD-1 in the peripheral blood of the women between the POI group and the control

注：A正常女性CD4+T細胞百分比；B正常女性CD8+T細胞百分比；C正常女性CD4+PD-1+T細胞百分比；D正常女性CD8+PD-1+T細胞百分比；E為POI組CD4+T細胞百分比；F為POI組CD8+T細胞百分比；G正常女性CD4+PD-1+T細胞百分比；H正常女性CD8+PD-1+T細胞百分比。

2.2 POI患者外周血CD4+和CD8+ T淋巴細胞百分比及其PD-1表達量與E2水平等的相關性

POI患者血清E2水平與CD4+T淋巴細胞百分比呈正相關(r=0.530，P=0.001)，與CD8+T淋巴細胞百分比無相關性(r=-0.131，P=0.363)；血清E2水平與CD4+PD-1+和CD8+PD-1+表達量均呈正相關(r=0.415，P=0.003；r=0.437，P=0.000)；血清E2水平與AMH水平呈正相關(r=0.589，P<0.001)。

POI患者血清AMH水平與CD4+T淋巴細胞百分比呈正相關(r=0.504，P=0.004)，與CD8+T淋巴細胞百分比呈負相關(r=-0.430，P=0.002)；血清AMH水平與CD4+PD-1+和CD8+PD-1+表達量均呈正相關(r=0.415，P=0.003；r=0.649，P<0.001)。

POI患者血清促甲狀腺激素(thyroid stimulating hormone，TSH)水平與CD4+T淋巴細胞百分比呈負相關(r=-0.400，P=0.004)，與CD8+T淋巴細胞百分比呈正相關(r=0.467，P=0.001)；血清TSH水平與CD4+PD-1+和CD8+PD-1+表達量均呈負相關(r=-0.340，P=0.016；r=-0.352，P=0.012)；血清TSH水平與AMH水平呈負相關(r=-0.484，P<0.05)。

3討論

POI是育齡期女性中較常見的生殖障礙性疾病，發病機制復雜，大多無明確的病因。有研究表明，細胞免疫異常是POI發病的免疫學機制之一[4]。另有研究顯示，女性進入絕經狀態后予以雌激素替代治療，可以調節T細胞亞群免疫平衡，改善免疫功能[5]。但目前有關POI患者T淋巴細胞亞群變化的研究較少，且結論各異，尚不能準確描述T淋巴細胞亞群數量在POI患者中的變化及作用。近年來國家調整了生育政策，保存女性生育能力日趨重要，而對POI患者進行行之有效的干預刻不容緩。

3.1 POI患者外周血T淋巴細胞亞群的變化

秦姍等[6]研究發現，POF患者CD4+T淋巴細胞含量下降，CD8+T淋巴細胞含量上升，CD4+/CD8+T降低。但Tuohy等[7]在POF患者與自身免疫的相關研究中表明，POF患者外周血中，CD4+/CD8+T明顯升高。本研究顯示，與正常女性相比，研究組POI患者外周血中CD4+T淋巴細胞亞群百分比下降，CD8+T淋巴細胞亞群百分比升高；但CD4+/CD8+變化無明顯差異，考慮可能與樣本量不足有關。

PD-1表達于T淋巴細胞表面，是免疫抑制分子之一，T淋巴細胞增殖后，PD-1表達量增加，并產生負向刺激信號，使T淋巴細胞發生凋亡，功能受到抑制。PD-1與其配體可參與自身免疫性疾病及腫瘤等多種疾病的病理進程。T淋巴細胞表面PD-1分子與其配體PD-L1結合后對T淋巴細胞功能產生負向作用，其增殖、活化能力明顯降低[8]。在慢性乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)感染中，PD-1/PD-L1發揮著很重要的作用，在肝炎活動期PD-1表達量上調，在恢復期下調[9]，其表明PD-1的過度上調與T淋巴細胞衰竭和持續性病毒感染有關。近年來的研究集中于以PD-1為靶點，使用PD-1/PD-L1抑制劑對腫瘤進行免疫調節治療，阻斷PD-1信號通路來治療各種腫瘤[10]，PD-1在細胞免疫功能紊亂的過程中發揮著不可或缺的作用。本研究顯示，POI患者外周血T淋巴細胞表面PD-1表達量降低，考慮其細胞免疫功能紊亂與PD-1表達異常存在一定的聯系。

3.2 E2與外周血T淋巴細胞數量變化及PD-1表達的相關性

雌激素水平在免疫功能調節中發揮著舉足輕重的作用，女性相較于男性，其自身免疫性疾病發病率及自身免疫抗體檢出率均增高。Oktem等[11]關于系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)的研究表明，雌激素在免疫細胞上存在同源受體ER-α和ER-β，E2可以通過同源受體調節先天和適應性免疫應答中的免疫功能。邵明君等[12]的研究中通過切除小鼠卵巢后建立絕經模型，檢測其淋巴細胞及細胞因子水平發現，小鼠的E2水平與CD3+、CD4+T淋巴細胞數量變化存在相關關系，E2水平下降直接導致了T淋巴細胞各亞群數量降低。Polanczyk等[13]在人工絕經的小鼠模型中進行了有關E2與PD-1的研究，發現細胞內PD-1受體的表達與雌激素水平存在劑量依賴關系，增加小鼠體內E2水平，可導致外周血CD4+PD-1+表達量升高。Raimondi等[14]研究發現，E2可增強調節性T淋巴細胞(regulatory cells，Treg)PD-1的表達，激活Treg抑制功能。

本研究顯示，POI患者血清E2水平與CD4+T淋巴細胞百分比呈正相關，與CD8+T淋巴細胞百分比無相關性，與CD4+、CD8+T淋巴細胞表面PD-1表達量均呈正相關，這說明POI患者體內E2水平降低可能導致T淋巴細胞表面PD-1表達量及CD4+T淋巴細胞百分比均下降。POI患者E2水平降低后，通過CD8+T淋巴細胞表面E2受體發揮免疫作用，導致CD8+PD-1+表達量下降，PD-1對CD8+T淋巴細胞的抑制作用減弱，直接導致CD8+T淋巴細胞百分比上升；而CD4+T淋巴細胞百分比上升可能與Treg對CD4+T淋巴細胞增殖的抑制有關。POI疾病進展早期，E2水平因FSH升高維持于高水平階段，同時增強Treg表面PD-1的表達[15]，Treg凋亡增加，削弱了Treg對CD4+T淋巴細胞的抑制作用，導致CD4+T淋巴細胞百分比上升，但隨著卵巢功能進一步衰退，E2水平降低，導致CD4+T淋巴細胞數量下降。

3.3 TSH和AMH與外周血T淋巴細胞百分比及PD-1的相關性

在甲狀腺疾病相關研究中，有學者分析了951例POF患者的臨床資料，對其臨床特征和發病危險因素及合并癥進行分析，發現此類患者極易合并存在自身免疫性疾病史，其中以自身免疫性甲狀腺炎最常見[16]。橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto′s thyroiditis，HT)是一種特異性自身免疫性疾病，發病過程中CD4+T淋巴細胞免疫功能紊亂，促進甲狀腺抗體的產生，破壞甲狀腺腺泡，引起甲狀腺激素水平下降。由此可見，免疫系統紊亂極大地影響了甲狀腺功能。Hu等[17]研究發現，HT發病機制與CD4+T淋巴細胞各亞群穩態失衡有關。本研究顯示，POI患者血清TSH水平與CD4+T淋巴細胞百分比、CD8+T淋巴細胞百分比均具有相關關系，可考慮POI患者體內雌激素水平下降之后，T淋巴細胞亞群受雌激素水平的影響，引發CD4+T淋巴細胞免疫功能紊亂，影響了甲狀腺功能，導致TSH水平上升。

綜上所述，POI發病過程中，免疫功能與神經內分泌網絡之間存在著復雜的聯系，隨著生殖醫學的飛速發展，將為其發病機理的研究開辟新的途徑。本研究探討POI患者外周血E2水平與CD4+、CD8+T淋巴細胞亞群及PD-1表達量變化的關系，有助于指導臨床診療工作，重視E2與免疫功能的相關性，盡早對POI患者進行雌激素補充治療。