卵泡液中SCF和SDF-1水平與POI的發生及胚胎發育的相關性研究

劉寶玲，張靜，衷雪梅，金萱△

原發性卵巢功能不全（primary ovarian insuffi?ciency，POI）是由卵巢自身損傷引起的一種卵巢功能障礙，患者主要癥狀是40歲前月經周期不規律，可通過檢測到卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，FSH）升高和雌二醇（estradiol，E2）降低而確診［1］。POI的發生機制包括卵泡儲備形成異常、卵泡閉鎖增加、優勢卵泡募集受損、卵泡成熟受阻、卵泡儲備過度消耗等，最終導致卵泡發育異常，影響女性生殖功能［2］。多種細胞因子通過旁分泌和自分泌在卵母細胞成熟和卵泡發育中起著重要作用，如抗苗勒管激素（anti-mullerian hormone，AMH）、干細胞因子（stem cell factor，SCF）、基質細胞衍生因子-1（stromal cell-derived factor-1，SDF-1）、成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，FGF）、骨形態發生蛋白、生長分化因子-9等［3-4］。有研究發現，SDF-1能抑制原始卵泡的激活［5］；而SCF能通過上調其受體c-kit mRNA表達和絲氨酸/蘇氨酸激酶磷酸化參與卵泡發育，促進原始卵泡的激活［6］。本研究通過分析POI患者卵泡液中SDF-1和SCF的表達特點及其相關性，探討SDF-1和SCF在POI發生發展中的作用，同時初步研究卵泡液SCF水平對輔助生殖治療中胚胎發育情況的預測作用。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2020年10月—2021年1月于南昌大學第一附屬醫院輔助生殖中心行體外受精（IVF）治療的144例不孕患者。POI診斷標準：年齡＜40歲，FSH＞20 IU/L［7］。144例中POI患者（POI組）44例。將無基礎卵巢疾病，因輸卵管或男方因素就診的不孕患者根據年齡分為高齡組（年齡≥40歲，40例）和正常組（年齡＜40歲，60例）。排除標準：（1）甲狀腺、腎上腺等疾病。（2）多囊卵巢綜合征、子宮內膜異位癥、子宮畸形、宮腔粘連。（3）既往有結核病史、糖尿病史等其他系統疾病。根據卵泡液SCF水平，將POI組分為＜200 ng/L組、200~300 ng/L組和＞300 ng/L組3個亞組。

1.2 標本采集及檢測 患者行促排卵治療后，于取卵日留取第1管卵泡直徑≥16 mm且無明顯血染的卵泡液，3 000 r/min離心10 min后，取上清液留置于Eppendorf管，標記后-80℃保存待測。采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）法，按照ELISA試劑盒（江蘇晶美生物公司）操作說明，分別檢測已收集卵泡液中E2、SDF-1和SCF的蛋白表達水平。

1.3 觀察指標 于月經周期第2～3天檢測基礎FSH、AMH，基礎竇卵泡數為月經周期第2～4天測得的2～10 mm直徑的卵泡數量。正常受精率=正常受精卵子數/加精卵子總數×100%；卵裂率=D2卵裂胚胎數/正常受精卵子數×100%；優胚率=優質胚胎數/正常受精卵子數×100%。優質胚胎定義為來源于正常受精卵，且受精后第3天胚胎細胞數為7~9個、細胞大小符合發育階段、碎片程度小于10%、無多核化的胚胎。

1.4 統計學方法 采用SPSS 26.0軟件進行數據分析。計量資料用±s表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，若方差不齊行非參數檢驗；計數資料用例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；兩變量間相關性分析采用Spearman相關分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組基本情況的比較 3組間體質量指數（BMI）差異均無統計學意義（P＞0.05）。POI組與正常組間年齡差異無統計學意義（P＞0.05）；POI組基礎FSH高于正常組，基礎AMH、竇卵泡數低于正常組，差異有統計學意義（P＜0.05）；高齡組基礎FSH高于正常組，基礎AMH、竇卵泡數低于正常組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of basic conditions between the three groups表1 不同組間基本情況比較 （±s）

Tab.1 Comparison of basic conditions between the three groups表1 不同組間基本情況比較 （±s）

＊＊P＜0.01；a與正常組比較，P＜0.05。

組別正常組POI組高齡組F n 60 44 40年齡（歲）31.4±4.8 32.8±4.9 42.4±1.9a 87.174＊＊BMI（kg/m2）22.0±3.2 22.3±3.2 22.7±2.1 0.737基礎FSH（IU/L）7.0±2.4 23.2±2.6a 10.5±2.0a 589.400＊＊基礎AMH（μg/L）3.5±0.5 0.7±0.4a 1.1±0.5a 449.121＊＊竇卵泡數（個）9.8±4.6 4.6±2.2a 6.2±3.1a 27.780＊＊

2.2 不同組間卵泡液指標比較 POI組、高齡組的卵泡液SCF水平均高于正常組，POI組卵泡液E2、SDF-1均低于正常組，差異有統計學意義（P＜0.05）。高齡組與正常組間卵泡液E2、SDF-1差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

Tab.2 Comparison of the levels of E2,SDF-1 and SCF in follicular fluid between the three groups表2 不同組間卵泡液E2、SDF-1、SCF水平比較（±s）

Tab.2 Comparison of the levels of E2,SDF-1 and SCF in follicular fluid between the three groups表2 不同組間卵泡液E2、SDF-1、SCF水平比較（±s）

＊＊P＜0.01；a與正常組比較，P＜0.05。

組別正常組POI組高齡組F n 60 44 40 E2（pmol/L）49.1±20.4 35.0±6.7a 43.5±13.4 9.019＊＊SDF-1（ng/L）9 760.4±2 309.2 7 539.3±1 836.4a 10 066.8±2 921.8 15.044＊＊SCF（ng/L）74.1±58.3 264.9±83.0a 144.6±89.3a 74.590＊＊

2.3 卵泡液中SCF與SDF-1的相關性 POI組卵泡液中SCF與SDF-1水平呈負相關（rs=-0.400，P＜0.05），正常組+高齡組患者（無卵巢疾病）卵泡液中SCF與SDF-1水平未見明顯相關性（rs=0.201，P＞0.05），見圖1。

2.4 卵泡液中SCF與E2的相關性分析 POI組卵泡液中SCF與E2水平呈正相關（rs=0.341，P＜0.05），正常組+高齡組患者（無卵巢疾病）卵泡液中SCF與E2水平未見明顯相關性（rs=0.031，P＞0.05），見圖2。

Fig.1 Correlation analysis of SCF and SDF-1 levels圖1 SCF與SDF-1水平相關性分析

Fig.2 Correlation analysis of SCF and E2 levels in follicular fluid圖2 SCF與E2水平相關性分析

2.5 卵泡液中SCF水平與胚胎發育的關系 POI組的3個SCF水平亞組間正常受精率、卵裂率差異均無統計學意義（P＞0.05）；＜200 ng/L組、200～300 ng/L組的優胚率均低于＞300 ng/L組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表3。

3 討論

卵巢是女性產生和排出卵子的性腺，具有生殖和內分泌雙重功能。卵泡主要由卵母細胞及其周圍的顆粒細胞組成，卵泡發育經歷了原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡、竇卵泡和排卵前卵泡，并最終排卵［3］。內源性或外源性因素引起卵泡任一階段的發育異常，均有可能導致POI。POI除導致不孕外，還會增加骨折、情緒障礙、心血管疾病、2型糖尿病等多系統疾病的風險［8-9］。因此研究POI的發病機制和治療方法十分必要。

Tab.3 Comparison of embryo development in POI subgroups表3 POI亞組內胚胎發育情況的比較

SCF是一種二聚體分子，通過結合并激活酪氨酸激酶受體c-kit發揮生物學功能。SCF/c-kit系統在造血、配子發育、黑色素生成、切口愈合等過程中發揮重要作用［10］。在成熟的卵巢中，c-kit在卵母細胞中表達，而SCF主要由顆粒細胞分泌，SCF、c-kit相互作用，在卵母細胞和顆粒細胞之間建立通信，參與原始卵泡的發育、初級卵泡的生長和排卵前卵泡的出現［11］。SCF/c-kit被認為在卵泡形成中起關鍵調控作用，SCF促進了原始卵泡到次級卵泡的生長，與原始卵泡的激活相關［6］。有研究在卵巢早衰大鼠的卵巢組織中觀察到SCF mRNA和蛋白表達水平高于正常對照大鼠［12］。本研究結果顯示POI組患者卵泡液SCF水平明顯高于正常組，提示高表達的SCF可能通過過度刺激原始卵泡的激活導致卵巢儲備減少，引發POI。高齡患者基礎FSH水平高于正常組，基礎AMH、竇卵泡數低于正常組，表明高齡患者卵巢儲備低于正常組患者；而高齡組卵泡液SCF水平高于正常組，提示SCF與高齡患者卵巢儲備減退發生機制有關。卵泡液中參與調節卵泡發育的細胞因子不是相互獨立的，它們之間也會有聯系，如AMH對SCF的負調控作用［13-14］，過表達的FGF-2對SCF旁分泌的促進作用［15］，SCF和內源性轉化生長因子（TGF）-β之間的關聯［16］等。SCF與其他細胞因子之間的作用機制值得深入研究。

SDF-1也稱為CXC趨化因子配體12（CXCL12），通過與其特異性受體CXCR4結合參與腫瘤轉移、中樞神經系統發育、心臟重構、血管生成等過程［17］。本研究結果顯示，POI組患者卵泡液SDF-1低于正常組，同時POI組卵泡液中SCF與SDF-1水平呈負相關，而正常、高齡組患者卵泡液中SCF與SDF-1水平未見明顯相關性，提示在POI的發生發展中SCF與SDF-1之間可能存在相互作用機制。有研究表明SDF1/CXCR4信號通路可能在維持原始卵泡池的大小和壽命方面發揮重要作用，使卵泡處于非激活狀態［5］，而SCF促進了原始卵泡的激活。SCF與SDF-1之間的相互作用可能與它們在維持原始卵泡池中相反的作用有關，具體的作用機制還需進一步的研究。

對于有生育要求的POI患者，通過輔助生殖技術獲得妊娠已經成為重要的治療手段。輔助生殖治療中胚胎發育結局的預測指標的相關研究更有意義。為研究SCF對POI患者胚胎發育情況的預測作用，本研究將POI組患者按SCF水平分為3個亞組并進行胚胎發育情況比較，結果顯示＜200 ng/L組、200～300 ng/L組的優胚率均低于＞300 ng/L組，這提示對POI患者來說，相對高水平的卵泡液SCF可能預示相對較高水平的胚胎質量。本研究發現POI患者卵泡液中SCF與E2水平呈正相關，E2是促進卵母細胞、卵泡發育的重要影響因素。POI指的是從不規則排卵到過早絕經的一個連續的卵巢功能衰退過程，部分確診患者有時還會自發地出現卵泡發育、月經回潮、妊娠［18］。在POI發展早期，機體可能存在補償機制以維持卵巢生殖和內分泌功能。筆者認為，SCF可能參與了這一補償機制，使得部分POI患者SCF水平進一步升高，促進了胚胎發育。有研究表明，SCF顯著增加了水牛卵母細胞直徑，促進了水牛卵母細胞的成熟［19］。SCF對卵母細胞生長的促進作用，可能是預測胚胎發育的重要原因。有一項基于人類3PN胚胎和小鼠2PN胚胎的研究發現，添加SCF促進了優質胚胎、囊胚和優質囊胚的形成，同時添加SCF和c-kit抑制劑會削弱這種促進作用［20］，提示SCF對胚胎發育具有一定預測作用。但也有研究表明在卵巢低反應的患者中，血清或卵泡液中的SCF水平并不能預測接受體外受精患者的卵母細胞提取率［21］。這可能與POI和卵巢低反應的發病機制不同有關。關于卵泡液SCF對接受輔助生殖治療患者胚胎發育情況的預測作用還需要更大樣本量的研究進一步探討。

綜上所述，POI患者和高齡患者卵泡液中SCF呈高水平表達，SCF可能與POI的發生、發展和高齡導致的卵巢儲備降低有關。POI患者卵泡液中SCF與SDF-1水平呈負相關，推測兩者可能在原始卵泡池維持上有相互作用機制，共同誘發POI。卵泡液SCF水平可能是預測POI患者IVF治療后胚胎發育的重要預測指標。本研究為原發性卵巢功能不全發生發展的機制研究提供了新證據，為其臨床治療提供了新思路。