慢性乙型病毒性肝炎患者血清25-羥基維生素D3水平與外周血T淋巴細胞亞群相關性分析

栗紅江， 胡素玲， 劉 洋， 孫靜瑋， 耿坤靜

保定市人民醫院1.消化三科；2.功能科；3.檢驗科；4.健康管理中心，河北 保定 071000

慢性乙型病毒性肝炎(chronic hepatitis B，CHB)是世界范圍內的流行性傳染病，全球每年約有100萬人死于CHB相關的肝衰竭或肝細胞癌[1]。CHB患者肝病變發展與抗病毒效果取決于免疫應答的性質、強度和范圍，有效的T細胞應答是控制病毒感染的關鍵[2]。但目前，有關T淋巴細胞對乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)產生免疫耐受的機制尚不明確。維生素D參與細胞的增殖、分化，對機體免疫系統有一定的調節作用，且CHB患者普遍存在維生素D缺乏或不足[3]。有研究發現，慢性丙型病毒性肝炎患者采用聚乙二醇干擾素聯合利巴韋林抗病毒的治療效果會受到維生素D水平的影響，維生素D缺乏可能是造成抗病毒治療無應答的原因之一[4]。維生素D對慢性丙型病毒性肝炎治療的效果影響也推動了其在CHB中的研究，并發現維生素D對CHB的影響可能與維生素D的免疫調節功能有關，正常維生素D水平的CHB患者乙肝e抗原(hepatitis B e antigen，HBeAg)轉陰率更高[5]。此外，循環血T淋巴細胞亞群與CHB患者細胞免疫狀態有明顯關聯，是影響機體對HBV清除能力與肝纖維化情況的重要因素，但有關CHB患者維生素D水平與肝纖維化、外周血T淋巴細胞亞群的關系研究少見報道。飲食來源和皮膚合成的維生素D前體在肝中于25羥化酶作用下進行羥化反應形成25羥維生素D3[25-dihydroxyvitam in D3，25(OH)D3]，是血液循環中維生素D的主要形式。本研究旨在探討CHB患者血清25(OH)D3水平與肝纖維化進展及外周血T淋巴細胞亞群的關系。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取自2018年5月至2020年4月保定市人民醫院收治的140例CHB患者為研究對象。納入標準：(1)符合《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》[6]中CHB的診斷標準；(2)無抗病毒藥物及免疫調節劑治療史；(3)無甲、丙等其他肝炎感染者；(4)無長期飲酒史；(5)均行肝穿刺病理活檢；(6)患者簽署知情同意書。排除標準：(1)入組前半年內服用過鈣劑、維生素D制劑、二磷酸鹽、降鈣素、雌激素、糖皮質激素者；(2)伴心、腦、腎等器官功能不全者；(3)伴糖尿病、骨質疏松等可能影響維生素D水平的疾病者；(4)伴酒精性或脂肪性肝病、遺傳代謝性肝病、藥物性肝病、自身免疫性肝病者；(5)伴膽汁淤積性疾病、肝血液循環障礙性疾病者。根據血清25(OH)D3水平將患者分為嚴重缺乏組[25(OH)D3<10 ng/ml，n=45]、不足組[25(OH)D3 10～30 ng/ml，n=55)和充足組[25(OH)D3>30 ng/ml，n=40]。嚴重缺乏組中，男性23例，女性22例；平均年齡(35.89±5.63)歲；HBV感染時間(9.54±3.16)年。不足組中，男性30例，女性25例；平均年齡(33.65±5.28)歲；HBV感染時間(10.29±3.33)年。充足組中，男性22例，女性18例；平均年齡(35.76±5.61)歲；HBV感染時間(10.62±3.52)年。各組患者一般資比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 研究方法

1.2.1 血清學指標檢測 于晨起空腹狀態下采集5 ml外周靜脈血，3 500 r/min離心10 min，留取分離血清待測。采用貝克曼AU680全自動生化分析儀檢測谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、總膽紅素(total bilirubin，TB)，其中ALT、AST檢測試劑購自新健康成生物股份有限公司；TB試劑購自北京瑞正醫療科技有限公司。采用電化學發光法(羅氏ROCHE E601及配套試劑)檢測血清HBeAg，Cut off指數<1.0為陰性，否則為陽性。采用上海宏石全自動熒光定量PCR儀SLAN-96P檢測HBV-DNA，檢測試劑購自圣湘生物。采用流式細胞術(邁瑞BriCyte E6流式細胞儀及配套試劑)檢測T淋巴細胞亞群。采用衍射光譜法(奧林巴斯AU680全自動生化分析儀)測定25(OH)D3，檢測試劑購自北京九強生物。所有檢測均嚴格按說明書操作。

1.2.2 肝纖維化檢測 采用Fibroscan測定肝彈性測量值(liver stiffness measurement，LSM)，判定肝纖維化程度[7]：對于TB正常且轉氨酶異常者，LSM≥17.5 kPa為肝硬化，12.4～17.5 kPa為進展性肝纖維化，9.4～12.4 kPa為顯著肝纖維化，7.4～9.4 kPa為輕度肝纖維化，LSM<7.4 kPa為無肝纖維化；對于轉氨酶及TB均正常者，LSM≥12.0 kPa為肝硬化，9.0～12.0 kPa為進展性肝纖維化，6.0～9.0 kPa為輕度肝纖維化，LSM<6.0 kPa為無肝纖維化。

2 結果

2.1 各組患者血清學指標比較 各組血清ALT、AST、TB及HBV-DNA比較，差異無統計學意義(P>0.05)。嚴重缺乏組HBeAg陽性率明顯高于不足組和充足組，差異有統計學意義(P<0.05)。不足組與充足組HBeAg陽性率比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組患者血清學指標比較

2.2 各組患者外周血T淋巴細胞亞群比較 嚴重缺乏組CD3+、CD4+、CD4+/CD8+T細胞低于不足組與充足組，且不足組低于充足組，差異有統計學意義(P<0.05)；嚴重缺乏組CD8+T細胞高于不足組與充足組，且不足組高于充足組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組外周血T淋巴細胞亞群比較

2.3 各組患者肝纖維化程度比較 嚴重缺乏組與不足組的進展性纖維化比例明顯高于充足組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組患者肝纖維化程度比較/例(百分率/%)

2.4 相關性分析 CHB患者血清25(OH)D3與LSM呈負相關(r=-0.257，P<0.05)，與CD4+/CD8+呈正相關(r=0.227，P<0.05)；LSM與CD4+/CD8+呈負相關(r=-0.194，P<0.05)。

3 討論

維生素D在細胞增生、分化、機體免疫功能、抗炎、抗纖維化等方面均有明顯作用，可對慢性肝病的進展及治療效果產生明顯影響。有研究表明，維生素D受體可在人體肝、胰腺、消化道上皮細胞和單核細胞，以及巨噬細胞、T淋巴細胞等免疫細胞中表達[8]。維生素D受體被維生素D激活后會促進上述免疫細胞中維生素D合成酶的生成，將血清中低活性的維生素D轉化為高活性的25(OH)D3，進而通過自分泌或旁分泌等途徑調節免疫細胞功能[9]。

本研究結果顯示，嚴重缺乏組的HBeAg陽性率明顯高于不足組和充足組，提示較高水平的25(OH)D3有利于促進CHB患者的HBeAg自發清除，與既往研究[10]結果一致。CHB屬于異質性疾病，不同患者的病毒復制水平有所不同，肝組織炎癥輕重也各異，兩者的平衡制約著感染的轉歸，反映機體的免疫狀態，而免疫功能和病毒復制也決定了肝病變程度，較弱的免疫功能與較高水平的病毒復制能力會促進肝纖維化進展[11]。有效的T細胞應答對控制CHB患者的病毒感染與復制起關鍵作用，成為CHB的研究熱點。T淋巴細胞亞群可分為效應性T細胞或調節性T細胞，T細胞總數或不同T細胞亞群絕對數及比值的變化常與疾病的發生及機體免疫功能強弱有關[12]。本研究中，嚴重缺乏組的CD3+、CD4+、CD4+/CD8+T細胞低于不足組與充足組，且不足組低于充足組(P<0.05)；嚴重缺乏組CD8+T細胞高于不足組與充足組，且不足組高于充足組(P<0.05)，且血清25(OH)D3與CD4+/CD8+呈顯著正相關，提示較低水平25(OH)D3的患者免疫功能也越差。有研究表明，初始T淋巴細胞的活化依賴維生素D水平，T淋巴細胞受到HBV刺激后表達的維生素D受體需在維生素D作用下形成復合體，從而激活T淋巴細胞，較低水平的25(OH)D3在激活T淋巴細胞后的增生指數較低，難以完全滿足對HBV的殺滅作用，因此，CHB患者的25(OH)D3水平與CD4+/CD8+T細胞呈現出正相關性[13-14]。也有研究發現，維生素D還可抑制Th1型淋巴細胞的增生并抑制相關細胞因子分泌，使免疫應答向Th2型轉變，以此減輕Th1型細胞應答產生的組織損傷[15]。

HBV感染后啟動機體免疫反應，使CD8+T細胞與靶細胞接觸，誘導CD8+T細胞殺傷靶細胞，但與此同時也在HBV致敏后釋放顆粒酶和穿孔素，清除肝細胞內HBV的同時也會對肝細胞造成損傷，誘發肝組織炎癥，激活肝星狀細胞，促進膠原纖維合成與沉積，進而導致肝組織纖維化甚至進展為肝硬化[16-17]。隨著CD8+T細胞的消耗，為了維持免疫平衡的穩態，機體CD8+T細胞的分泌速度也會加快，造成CD8+T細胞的上調，CD4+/CD8+減小。因此，CD4+/CD8+越小，機體免疫耐受越嚴重，肝纖維化也越重，使LSM與CD4+/CD8+呈顯著負相關。有研究認為，CHB患者因HBV感染，長期處于免疫耐受狀態，使機體免疫細胞數量及功能失衡，最終誘發肝組織持續炎癥與肝纖維化[18]。本研究結果顯示，嚴重缺乏組與不足組進展性纖維化患者的占比明顯高于充足組，且血清25(OH)D3水平與LSM呈負相關，提示較低水平的血清25(OH)D3更易造成肝纖維化的出現與進展。以上結果說明，CHB患者的血清25(OH)D3水平與機體T淋巴細胞之間存在一定的相關性，通過該途徑影響肝組織纖維化的進展，外源性補充維生素D有利于HBeAg的自發清除及強化免疫應答，從而減輕肝組織損傷并抑制肝纖維化進展。國外研究也表明，低水平25(OH)D3是重度肝纖維化的獨立危險因素，外源性補充維生素D可調節鈣磷代謝并抑制肝纖維化[19-20]，與本研究結果一致。

綜上所述，CHB患者維生素D水平可能影響T淋巴細胞亞群，并通過該途徑調控肝組織纖維化進展，未來需要更多的體內或體外研究來探討具體機制。本研究不足之處：肝纖維化診斷分級依據較為單一，且Fibroscan易受檢查者經驗、肝炎癥程度等因素影響，應進一步通過肝活檢、血清學等聯合檢查提高肝纖維化的診斷準確性。此外，羥化酶CYP2R1、CYP27A1和CYP24A1等也會影響25(OH)D3代謝，但本研究未能進行分析，可能造成一定的偏倚，有待后續完善研究。