趙景宏 劉濤 喬彥 張榮驛 鄧建平 王浩宇

(南充市中心醫院 1.心內科;2.內分泌科，四川 南充 637000)

心血管疾病(Cardiovascular disease，CVD)是慢性腎臟病(Chronic kidney disease，CKD)最常見的并發癥，是慢性腎臟病患者的主要死亡原因。然而，心臟疾病和腎臟疾病相互作用的具體機制仍不清楚[1-4]。硫酸吲哚酚(IS)是一種尿毒癥毒素，其在體內的累積與腎功能下降有關。尤其是晚期CKD患者血清中IS水平的增高與患者預后及CVD事件的風險明顯相關[5-6]。研究證實IS參與動脈粥樣硬化的發生發展，因為它可以通過增強氧化應激導致血管內皮細胞功能紊亂[7]。此外體外研究也顯示IS可通過激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和NF-kB(Nuclear factor-kappa B)信號通路促進心肌細胞肥大[8-9]。

MicroRNA(miRNA)是一種高度保守的非編碼RNA,可通過與靶基因3′-非編碼區(3′UTR)特異性結合調節基因表達，導致翻譯抑制或靶基因mRNA降解。miRNA已被證實在心血管疾病包括心肌梗死、心肌肥大和心肌缺血再灌注中發揮重要作用[10-13]。然而，由于miRNA可調節多個潛在靶基因，所以許多miRNA在心血管疾病中的作用還有待明確。既往研究表明過表達miR-223-3p可減輕缺血/再灌注誘導的心肌細胞損傷，促進心臟功能的恢復，然而其具體作用機制尚不清楚[14]。本研究探討miR-223-3p在IS誘導的H9c2細胞中的表達，對細胞活力的影響及其作用機制，以期為心血管疾病的治療提供新的作用靶點。

1 材料與方法

1.1 細胞培養與H9c2細胞損傷模型的建立 H9c2細胞購自美國菌種保藏中心(Manassas, VA, USA)。H9c2細胞在含有5%CO2和95%潮濕空氣環境中培養，室溫為37℃。培養基為含有10%胎牛血清(Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)、100 μg/mL鏈霉素和100單位/mL青霉素的DMEM培養基。H9c2細胞損傷模型建立如下：設空白對照組(不作任何處理)和不同濃度IS組(濃度分別為50、100、200、400、800 μmol/L)，培養24 h后檢測細胞活力。結果表明IS濃度為400 μmol/L時細胞相對活力最接近50%，因此后續實驗IS組濃度選擇400 μmol/L。

1.2 細胞轉染 miR-223-3p mimic, miR-223-3p mimic NC, NLRP3過表達載體pcDNA-NLRP3和空載體NLRP3 NC由GenePharma公司合成 (Shanghai, China)。根據制造商的說明，用轉染試劑Lipofectamine 3000(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)將其轉染到六孔板中的H9c2細胞。培養6～8 h后，用含有10%FBS的新鮮DMEM替換培養基再進行后續實驗。

1.3 CCK8 H9c2細胞以每孔5000個細胞的密度種植在96孔板，適當處理后混合10 μL CCK-8溶液和90 μL無血清DMEM，室溫下孵育2 h。根據制造商的說明，用CCK-8法(Shanghai Beyotime Biotechnology, Shanghai, China)測定細胞活力。然后用微孔板讀取器在450 nm波長處檢測光密度(OD)值。根據不同實驗內容進行不同分組，檢測IS對細胞活力的影響時分為空白對照組(不作任何處理)，陰性對照組(加入生理鹽水)和IS組。檢測miR-223-3p對細胞活力的影響時分為空白對照組(不作任何處理)、陰性對照組(miR-223-3p NC)和miR-223-3p過表達組(miR-223-3p mimic)。檢測NLRP3對細胞活力的影響時分為空白對照組(不作任何處理)、陰性對照組(NLRP3 NC)和NLRP3過表達組(pcDNA-NLRP3)。檢測miR-223-3p通過調控NLRP3增強細胞活力時分為空白對照組，陰性對照組(miR-223-3p NC)，miR-223-3p過表達組(miR-223-3p mimic)和miR-223-3p過表達+NLRP3過表達組(miR-223-3p mimic+pcDNA-NLRP3)。

1.4 RT-qPCR 使用Trizol試劑(invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc)從H9c2細胞中提取總RNA,并用nanodrop(nanodrop Technologies; Thermo Fisher Scientific, Inc.)測定RNA濃度。根據制造商的說明使用5X all-in-one rT MasterMix試劑盒(abmgoodchina inc.)將總RNA逆轉錄為cDNA,然后使用evagreen 2X qPcr MasterMix-low rox試劑盒在aBi 7500PCR檢測系統上進行檢測。引物序列如下：。2-ΔΔCT法評價基因相對表達水平。miR-223-3P:F: 5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′,R: 5′-CGGGCT GTCAGTTTGTCA-3′;Caspase-1:F：5′-GCCTTGCC CTCATAATCT-3′, R：5′-ACATCTGGGACTTCTT CG-3′。檢測IS對miR-223-3P表達的影響，分組如下：空白對照組(不作任何處理)，陰性對照組(加入生理鹽水)和IS組。

1.5 Western blot 培養的H9c2細胞在RIPA(Beyotime institute of Biotechnology)裂解緩沖液中裂解，通過BCA法(Beyotime institute of Biotechnology)檢測總蛋白濃度。含有50 μg的蛋白樣品在6%～10%SDS-PAGE凝膠上電泳分離，再將蛋白轉移至聚偏氟乙烯膜上。室溫下用5%脫脂牛奶在TBS-0.05% Tween-20溶液中封閉1 h,然后在4℃下加NLRP3一抗(1∶1000稀釋；cat. no. ab98151)培養過夜。用PBS液洗滌3次，加二抗孵育2 h。蛋白質的表達用增強化學發光法和Tanon-5200化學發光成像儀進行檢測。檢測了miR-223-3p對NLRP3蛋白表達的影響，分組如下：空白對照組(不作任何處理)和miR-223-3p過表達組(miR-223-3p mimic)。

1.6 熒光素酶報告分析法 熒光素酶報告質粒psiCHECK- NLRP3-3′-UTR野生型(WT)和psiCHECK- NLRP3-3′-UTR突變型(MUT)由上海基因制藥有限公司構建，在NLRP3的3′-UTR中含有野生型和突變型miR-223-3p結合位點，通過Lipofectamine 3000轉染到H9c2細胞。24 H后使用Nano-Glo Promega熒光素酶報告系統(Promega, Madison, WI,USA)檢測熒光素酶活性。分組如下：陰性對照組(NC，加入生理鹽水)和miR-223-3p過表達組(miR-223-3p，轉染miR-223-3p mimic)。

1.7 ELISA法 采用酶聯免疫吸附法檢測H9c2細胞上清液中Caspase-1和IL-1β的表達水平。根據制造商的說明采用Elisa試劑盒(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)進行檢測，使用微孔板讀取器在450nm處測定OD值。檢測miR-223-3p對Caspase-1和IL-1β表達水平的影響時分為空白對照組(不作任何處理)，陰性對照組(miR-223-3p無義序列組)和miR-223-3p過表達組(miR-223-3p mimic)。檢測NLRP3對caspase-1和IL-1β表達的影響時分為空白對照組(不作任何處理)、陰性對照組(NLRP3 NC)和NLRP3過表達組(pcDNA-NLRP3)。檢測miR-223-3p通過NLRP3調控caspase-1和IL-1β表達時分為空白對照組(不作任何處理)，陰性對照組(miR-223-3p NC)，miR-223-3p過表達組(miR-223-3p mimic)和miR-223-3p過表達+ NLRP3過表達組(miR-223-3p mimic+ pcDNA-NLRP3)。

2 結果

2.1 IS對細胞活力的影響 與空白對照組(0.99±0.03)相比，不同濃度的IS(50、100、200、400、800 μmol/L)對H9c2細胞活力均有抑制作用(分別為0.87±0.03、0.79±0.03、0.67±0.04、0.51±0.04、0.43±0.04)。因為IS濃度為400 μmol/L時細胞相對活力最接近50%，故后續選用這個濃度作為H9c2細胞損傷造模濃度，見圖1。

圖1 IS對細胞活力的影響

2.2 miR-223-3P在各組中的表達 RT-qPCR檢測各組H9c2細胞中miR-223-3P表達水平，結果顯示和空白對照組(0.98±0.04)及陰性對照組(0.97±0.03)相比，IS組細胞miR-223-3P表達水平明顯降低(0.69±0.04)，差異有統計學意義(P<0.05)，空白對照組和陰性對照組中miR-223-3P表達水平差異無統計學意義(P>0.05),見圖2。

圖2 miR-223-3p在各組中的表達水平

2.3 各組細胞中細胞活力表達水平 與空白對照組和陰性對照組相比，IS組中H9c2細胞活力明顯降低(分別為0.97±0.03、0.95±0.04、0.52±0.04)，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3。

圖3 各組細胞活力水平

2.4 miR-223-3p可靶向結合NLRP3 通過生物信息學數據庫Targetscan(http://www.targetscan.org/vert_71/)發現NLRP3存在與miR-223-3p結合位點，進一步通過雙熒光素酶實驗證實miR-223-3p可與NLRP3靶向結合，見圖4、圖5。

圖4 miR-223-3p與NLRP3結合位點

圖5 相對熒光素酶活性測定

2.5 miR-223-3p負調控NLRP3表達 Western blot結果顯示，與空白對照組相比，miR-223-3p mimic組中NLRP3蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)，證實miR-223-3p可負調控NLRP3蛋白表達，見圖6。

圖6 miR-223-3p對NLRP3蛋白表達的影響

2.6 過表達miR-223-3p對細胞活力的影響 將添加IS的H9c2細胞分為空白對照組、陰性對照組(miR-223-3p NC)和miR-223-3p過表達組，CCK8檢測細胞活性，結果顯示與空白對照組(0.52±0.05)和陰性對照組相比(0.54±0.06)，miR-223-3p過表達組(0.71±0.06)細胞活性明顯增強，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖7。

圖7 miR-223-3p對細胞活力的影響

2.7 過表達miR-223-3p對caspase-1和IL-1β表達的影響 Elisa結果顯示，和空白對照組及陰性對照組(miR-223-3p無義序列組)相比，miR-223-3p過表達組中caspase-1和IL-1β表達水平均明顯降低(P<0.05)，見表1。

表1 各組細胞中caspase-1和IL-1β水平

2.8 過表達NLRP3對細胞活力的影響 將添加IS的H9c2細胞分為空白對照組、陰性對照組(NLRP3 NC)和NLRP3過表達組，細胞活力檢測結果顯示與空白對照組(0.57±0.08)和陰性對照組相比(0.55±0.06)，NLRP3過表達組(0.31±0.05)中H9c2細胞活力明顯降低(P<0.05)，見圖8。

圖8 NLRP3對細胞活力的影響

2.9 過表達NLRP3對caspase-1和IL-1β表達的影響 與空白對照組及陰性對照組(NLRP3 NC)相比，過表達NLRP3可明顯增強H9c2細胞中caspase-1和IL-1β表達水平(P<0.05)，見表2。

表2 各組細胞中caspase-1和IL-1β水平

2.10 miR-223-3p通過調控NLRP3增強細胞活力 與空白對照組(0.50±0.07)和陰性對照組(0.48±0.08)相比，miR-223-3p過表達組(0.70±0.06)中細胞活力明顯增強(P<0.05)，但是與miR-223-3p過表達組相比，miR-223-3p過表達+ NLRP3過表達組(0.59±0.06)中細胞活力則有所降低(P<0.05)，說明miR-223-3p通過抑制NLRP3表達增強細胞活力，見圖9。

圖9 miR-223-3p通過調控NLRP3增強細胞活力

2.11 miR-223-3p通過調控NLRP3抑制caspase-1和IL-1β表達 與空白對照組和陰性對照組相比，miR-223-3p過表達組中caspase-1和IL-1β表達水平明顯降低(P<0.05)，但與miR-223-3p過表達組相比，miR-223-3p過表達+ NLRP3過表達組中caspase-1和IL-1β表達水平則有所增高(P<0.05)，證實NLRP3可逆轉miR-223-3p對caspase-1和IL-1β表達的抑制作用，見表3。

表3 各組細胞中caspase-1和IL-1β水平

3 討論

有研究[15]表明心血管疾病患者的心血管死亡率和全因死亡率與腎小球濾過率的下降相關，然而慢性腎損害促進心血管疾病發生發展的作用機制非常復雜，因此需要對其機制進行更深入系統的研究。

miRNA在胚胎發育、增殖、血管生成、凋亡、細胞生長、分化和腫瘤發生等多種生物學過程中發揮重要作用。在心血管系統中，miRNA還參與血管生成、心肌細胞收縮、脂質代謝與控制、斑塊形成、心律失常和心肌細胞生長[16]。既往研究發現miR-223-3p可減輕缺血/再灌注誘導的心肌損傷，但是其在慢性腎臟病所致心血管疾病中的作用尚未見報道。本研究通過IS建立小鼠心肌H9c2細胞損傷模型，發現與空白對照組和陰性對照組相比，IS組中miR-223-3p表達水平明顯降低，但是過表達miR-223-3p可明顯增強H9c2細胞活性，減輕IS誘導的細胞損傷，證實miR-223-3p對IS誘導的心肌H9c2細胞的保護作用。

本研究進一步探討了miR-223-3p發揮心肌細胞保護作用的具體機制。結果顯示miR-223-3p可能以NLRP3依賴的方式調控心肌細胞活性。NLRP3炎性小體是一種細胞溶質蛋白復合物，由NLRP3、ASC(apoptosis-associated speck-like protein)和pro-caspase-1組成。NLRP3炎性小體是在一些內源性“危險信號”比如氧化應激、溶媒體失穩和線粒體功能障礙的刺激下組裝形成的[17]。研究表明NLRP3炎性小體的激活與多種炎性疾病的發病機制密切相關[18-19]，它可通過活化的caspase-1引起多種促炎細胞因子如IL-1β和IL-18的成熟和分泌[20]。而分泌的IL-1β和IL-18可加重炎癥，最終導致細胞溶解和細胞焦亡[21]。既往研究證實心肌缺血和心肌損傷常伴有嚴重的炎癥反應[22],作為炎癥反應的核心，NLRP3炎性小體被認為是眾多炎癥性疾病的關鍵因子，并且有研究證明抑制NLRP3信號通路對冠狀動脈結扎引起的心肌缺血和損傷具有保護作用[23]。研究結果表明過表達NLRP3可促進caspase-1和IL-1β表達水平的增高并可導致H9c2細胞活性降低，與既往研究結果相符。結果還發現過表達miR-223-3p可下調caspase-1和IL-1β的表達水平，為驗證miR-223-3p是否通過NLRP3炎性小體通路調控細胞活性，進行了功能回復實驗，結果顯示與空白對照組和陰性對照組相比，miR-223-3p過表達組中細胞活力明顯增強，但是與miR-223-3p過表達組相比，miR-223-3p過表達+ NLRP3過表達組中細胞活力則有所降低，說明NLRP3可逆轉miR-223-3p對細胞活力的增強作用，發現與miR-223-3p過表達組相比，miR-223-3p過表達+ NLRP3過表達組中caspase-1和IL-1β表達水平則有所增高，證明NLRP3可逆轉miR-223-3p對caspase-1和IL-1β表達的抑制作用。上述結果證實miR-223-3p通過負調控NLRP3表達，抑制炎性小體形成并下調caspase-1和IL-1β的表達水平增強細胞活力。

4 結論

本研究結果發現，miR-223-3p在IS誘導的H9c2細胞中的表達水平明顯降低，過表達miR-223-3p可明顯增強H9c2細胞活力，miR-223-3p可靶向結合NLRP3并負調控NLRP3表達，miR-223-3p可能是通過調控NLRP3抑制caspase-1和IL-1β表達從而增強H9c2細胞活力。本研究對慢性腎疾病相關心肌細胞損傷的病因和治療提供了新的認識，且加深了心腎相互作用機制的理解。但是本實驗只做了細胞層面的研究，還需要開展動物實驗加以驗證。