miR-583靶向調控DDX5促進HBV復制和表達*

黃學蘭 王妍柏 王銀鋒 李想

(寧夏醫科大學總醫院 1.醫學實驗中心；2.神經內科腦脊液檢測室，寧夏 銀川 750004)

乙型肝炎是嚴重危害人類健康的傳播性疾病，由病原體乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染引起[1]。相關研究報道，盡管HBV疫苗計劃降低了HBV感染的新發病率，但全世界仍有2.4億人攜帶HBV[2]。研究發現，慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B，CHB)患者體內HBV復制會激活機體的免疫病理反應，并誘導肝星狀細胞活化、增殖，導致CHB繼發肝纖維化、肝硬化和肝細胞癌等疾病，嚴重危及全球人類健康[3-4]。抑制HBV復制、表達的抗病毒治療是改善CHB的重要手段[5]。近年來發現，小RNA分子miRNA可在轉錄后發揮調控作用，參與機體的多種生理、病理機制，在HBV感染中的作用逐漸引起人們重視[6]。Zhang等[7]研究發現，miR-583在CHB不同中醫癥候患者體內差異表達。RNA解螺旋酶DDX5(DEAD box helicase5)是DEAD蛋白家族成員，參與RNA的合成、剪接及轉運，在多種腫瘤中高表達，在HBV復制期間被下調[8-9]。TargetScanHuman網站顯示，miR-583、DDX5存在靶向結合位點，但靶向調控關系尚未確認。本研究旨在探討miR-583靶向調控DDX5表達對HBV復制、表達的影響，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 人肝癌細胞HepG2、人穩轉HBV病毒的肝癌細胞HepG2.2.15(貨號：YS-0075X、YS-2193X)購自美國sciencell；DMEM培養基(貨號：PM150210)購自武漢益普生物科技有限公司；TRIzol試劑(貨號：abs60154)購自愛必信(上海)生物科技有限公司；miRNA實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)試劑盒(貨號：AOMD-Q050)購自美國GeneCopoeia；SYBR qPCR試劑盒(貨號：BK2200-2203)購自百奧邁科生物技術有限公司；LipofectamineTM3000轉染試劑(貨號：L3000015)購自美國Invitrogen；人乙型肝炎病毒s抗原(Hepatitis B s antigen，HBsAg)、乙型肝炎病毒e抗原(Hepatitis B e antigen，HBeAg)酶聯免疫(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(貨號：CSB-E10089h-1、CSB-E13557h-1)購自上海恒斐生物科技有限公司；HBV DNA檢測試劑盒(貨號：1529377106)購自上海將來實業股份有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(貨號：11402HZ60)購自上海滬震實業有限公司。

1.2 主要儀器 恒溫培養箱(型號：MIR-262-PC)購自日本松下公司；酶標儀(型號：SPECTR AmaxM2e)購自美國Molecular Devices公司；實時定量PCR儀(Rotor-Gene?Q)購自美國QIAGEN公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養 將HepG2、HepG2.2.15細胞培養于加入10%胎牛血清的DMEM培養基中，放在溫度為37℃、CO2體積分數為5%的細胞培養箱中培養，當細胞融合率達到80%時，用胰酶適度消化、傳代3次，取對數期細胞用于實驗。

1.3.2 qPCR法檢測 HepG2、HepG2.2.15細胞中miR-583、DDX5 mRNA表達，將HepG2、HepG2.2.15細胞接種于24孔板，細胞密度為1.0×105個/孔，培養24 h。TRIzol法提取HepG2、HepG2.2.15細胞中總RNA，紫外分光計、甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳測定RNA濃度、純度及完整性，逆轉錄得cDNA后，按照qPCR試劑盒說明書進行qPCR反應，2-ΔΔCt法計算miR-583、DDX5 mRNA表達水平。miR-583及其內參U6引物、DDX5及其內參GAPDH引物為上海杰美基因醫藥科技有限公司合成的特異性引物。miR-583反應程序：95℃預變性30 s，95℃變性15 s，60℃退火延伸30 s，共循環40次；DDX5反應程序：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火延伸30 s，共循環40次。

1.3.3 HepG2.2.15細胞分組 將HepG2.2.15細胞接種于24孔板，細胞密度為1.0×105個/孔，培養至細胞融合率達到80%時準備轉染。設置空白對照組、NC-siRNA組、miR-583 siRNA組。NC-siRNA組、miR-583 siRNA組使用LipofectamineTM3000轉染試劑轉染NC-siRNA和miR-583 siRNA，轉染步驟按照LipofectamineTM3000說明書進行。

1.3.4 qPCR法檢測各組HepG2.2.15細胞中miR-583、DDX5 mRNA表達 HepG2.2.15細胞轉染后培養24 h，按照1.3.2中的檢測步驟，qPCR法檢測各組HepG2.2.15細胞中miR-583、DDX5 mRNA表達水平，2-ΔΔCt法表示。

1.3.5 qPCR法檢測各組HepG2.2.15細胞上清液中HBV DNA水平 HepG2.2.15細胞轉染后培養24 h，離心收集細胞培養上清液，按照1.3.2中的檢測步驟，使用HBV DNA檢測試劑盒進行qPCR。反應程序：94℃預變性2 min，94℃變性10 s，60℃退火延伸30 s，共循環40次。反應結束后使用RG6000軟件分析計算HBV DNA拷貝數。

1.3.6 ELISA檢測各組HepG2.2.15細胞上清液HBsAg和HBeAg表達水平 HepG2.2.15細胞轉染后培養24 h，離心收集細胞培養上清液，按照HBsAg、HBeAg測定試劑盒說明書上的步驟進行操作，在酶標儀上讀取吸光度(optical density，OD)值，波長設定為450 nm，配置相應標準液并測定OD值，繪制標準曲線，計算HBsAg、HBeAg表達水平。

1.3.7 雙熒光素酶法驗證miR-583與DDX5的靶向關系 使用miRTarBase網站分析miR-583與DDX5的結合位點，構建DDX5的3′UTR-熒光素酶表達載體(野生型DDX5-WT和突變型DDX5-MUT)。以HepG2.2.15細胞基因組為模板，PCR擴增miR-583序列，采用EcoR I和BamH I雙酶切miR-583序列和pmiR-mCherry質粒，16℃過夜構建miR-583重組質粒，將miR-583重組質粒進行菌落PCR及測序驗證，然后提取重組質粒。使用LipofectamineTM3000轉染試劑將DDX5-WT、DDX5-MUT分別與pmiR-mCherry質粒和miR-583重組質粒一起轉入HepG2.2.15細胞，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書上的步驟進行操作，測定熒光強度，以螢火蟲、海腎熒光素酶活性比值表示熒光素酶相對活性。

2 結果

2.1 HepG2、HepG2.2.15細胞中miR-583、DDX5 mRNA表達 與HepG2細胞相比，HepG2.2.15細胞中miR-583表達水平顯著升高(P<0.05)，DDX5 mRNA表達水平顯著降低(P<0.05)，見表1。

表1 HepG2、HepG2.2.15細胞中miR-583、DDX5 mRNA表達水平比較

2.2 各組HepG2.2.15細胞中miR-583、DDX5 mRNA表達 空白對照組與NC-siRNA組HepG2.2.15細胞中miR-583及DDX5 mRNA表達水平差異無統計學意義(P>0.05)；與NC-siRNA組相比，miR-583 siRNA組HepG2.2.15細胞中miR-583表達水平顯著降低(P<0.05)，DDX5 mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組HepG2.2.15細胞中miR-583、DDX5 mRNA表達水平比較

2.3 各組HepG2.2.15細胞上清液中HBV DNA水平 空白對照組與NC-siRNA組HepG2.2.15細胞上清液中HBV DNA水平的差異無統計學意義(P>0.05)；與NC-siRNA組相比，miR-583 siRNA組HepG2.2.15細胞上清液中HBV DNA水平顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組HepG2.2.15細胞上清液中HBV DNA水平比較

2.4 各組HepG2.2.15細胞上清液HBsAg、HBeAg表達水平 空白對照組與NC-siRNA組HepG2.2.15細胞上清液中HBsAg、HBeAg表達水平差異無統計學意義(P>0.05)；與NC-siRNA組相比，miR-583 siRNA組HepG2.2.15細胞上清液中HBsAg、HBeAg表達水平顯著降低(P<0.05)。見表4。

表4 各組HepG2.2.15細胞上清液HBsAg、HBeAg表達水平比較

2.5 雙熒光素酶法驗證miR-583與DDX5的靶向關系 Target ScanHuman網站顯示，miR-583與DDX5存在靶向結合位點。雙熒光素酶實驗結果顯示，共轉染DDX5-MUT、pmiR-mCherry質粒與共轉染DDX5-MUT、miR-583重組質粒的HepG2.2.15細胞相對熒光素酶活性差異無統計學意義(P>0.05)；與共轉染DDX5-WT、pmiR-mCherry質粒的細胞相比，共轉染DDX5-WT、miR-583重組質粒的HepG2.2.15細胞相對熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)。見圖1、圖2、表5。

圖1 TargetScanHuman網站預測miR-583與DDX5的靶向結合位點

圖2 各組HepG2.2.15細胞相對熒光素酶活性比較

表5 各組HepG2.2.15細胞相對熒光素酶活性比較

3 討論

HBV是嗜肝DNA病毒，每年有至少一百萬人死于HBV相關的乙型肝炎及繼發的肝纖維化、肝硬化、肝衰竭和肝細胞癌等疾病[10-11]。目前藥物治療中尚無藥物有效清除體內的HBV，干擾素、核苷類似物等藥物可在一定程度上抑制病毒復制，但可能存在療效有限、停藥復發、存在較重的不良反應等局限性[12-13]。miRNA能通過降解靶基因mRNA或抑制靶基因mRNA翻譯來調控其靶基因轉錄后的表達水平，在抗炎、抗腫瘤、抗病毒感染、免疫應答等過程中均發揮重要的作用[14-15]。研究發現，在HBV感染過程中，HBV可通過其復制、表達的產物影響機體miRNA表達，從而增加其自身復制，促進自身的持續性感染，同時，宿主細胞miRNA可通過間接、直接的機制調控HBV的復制、表達，如直接靶向病毒RNA抑制HBV復制，靶向特異性宿主基因阻擋病毒繁殖，或激活特異性免疫應答消滅病毒等[16]。因此，miRNA在抗HBV治療中具有良好的應用前景。

miR-583是近年來常研究的miRNA，既往發現在調控腰椎間盤退變方面發揮重要作用，在腫瘤中亦有差異性表達[17-18]。目前有研究顯示，miR-583在不同中醫癥候的CHB患者體內差異表達，可能參與CHB進展[7]。本研究結果顯示，人穩轉HBV病毒的肝癌細胞HepG2.2.15中miR-583表達水平較人肝癌細胞HepG2顯著升高，提示miR-583可能參與HBV病毒感染過程，但其上調可能是HBV促進自身持續性感染的機制，但也可能是機體阻止HBV復制、繁殖的對抗保護機制。機體感染HBV后，HBV在肝細胞中復制并分泌HBsAg、HBeAg等標志物，這些標志物水平可用來評估HBV復制水平[19-20]。本研究結果顯示，下調miR-583表達后，HepG2.2.15細胞上清液中HBsAg、HBeAg表達水平均顯著降低，且HBV DNA拷貝數亦顯著降低，提示抑制miR-583表達可以顯著抑制HBV的蛋白分泌水平及DNA復制水平，從而抑制HBV表達，推測miR-583在HepG2.2.15細胞中表達上調更可能是HBV促進自身持續性感染的機制。

DDX5是ATP依賴的進化中高度保守的RNA解旋酶，在人類細胞核、細胞質中廣泛表達，參與RNA合成、剪接、轉運及核糖體生物合成、細胞增殖、凋亡等多種生物學過程[21-22]。劉歡等[23]研究表明，DDX5對病毒增殖具有抑制作用，可能與病毒復制轉錄過程負調控病毒基因組RNA、長鏈亞基因組sg mRNA轉錄有關[24]。本研究結果顯示，人穩轉HBV病毒的肝癌細胞HepG2.2.15中DDX5表達水平較人肝癌細胞HepG2顯著降低，提示DDX5在HepG2.2.15細胞中表達受到抑制，提示HBV病毒在HepG2.2.15細胞中促進自身的復制、增殖，其機制可能涉及對DDX5表達的抑制。生物信息學分析顯示，miR-583與DDX5存在靶向結合位點，可能存在靶向調控關系。雙熒光素酶實驗結果表明，miR-583與DDX5在HepG2.2.15細胞中確實存在靶向調控關系。mRNA檢測亦顯示，下調miR-583表達后，HepG2.2.15細胞中DDX5 mRNA水平顯著升高，提示下調miR-583表達會導致其靶基因DDX5表達升高，進而導致HBV病毒復制、增殖受到抑制。

4 結論

miR-583可能靶向抑制DDX5進而促進HBV復制、表達，并通過下調miR-583的表達而導致DDX5表達升高，進而抑制HBV病毒復制、表達，為探討CHB新的治療靶點提供了實驗依據。