李轉 杜岳峰 吳東娟 張夢姣 陳利娟

(1.空軍軍醫大學第一附屬醫院泌尿外科，陜西 西安 710032；2.西安交通大學第一附屬醫院泌尿外科，陜西 西安 710061)

前列腺癌(Prostatic cancer)位居男性常見腫瘤第二位，也是男性癌癥死亡的第二大原因[1]。由于人口老齡化，前列腺癌的發病率正在增加[2]。對無癥狀的男性進行早期檢測和治療可以降低死亡率和提高生活質量。前列腺特異性抗原(Prostate specific antigen, PSA)和前列腺酸性磷酸酶(Prostatic acid phosphatase, PAP)等標志物的篩查明顯提高了前列腺癌的早期診斷準確性[3]，然而，這些標志物的診斷價值仍存在爭議，因此，需探索新的高效診斷標志物。轉移相關蛋白2 (Metastasis-associated protein 2, MTA2)定位在染色體11q1213.1上，表達含668個氨基酸的蛋白，分子量是70kD。MTA2是Mi-2/核小體重塑脫乙酰酶復合物的核心成分，在轉錄水平上精確控制細胞骨架重組。此外，MTA2與腫瘤進展和轉移密切相關[4]。目前報道MTA2在前列腺癌中表達模式的文獻鮮少。因此，本研究探討MTA2對前列腺癌預后的預測價值，并探索其在癌轉移過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑 MTT(四唑鹽)、吉姆薩溶液和DAP購自美國Sigma-Aldrich。RPMI-1640培養基、胎牛血清(FBS)、青霉素/鏈霉素和0.25%胰蛋白酶購自美國HyClone。Opti-MEM、TRIzol購自美國Invitrogen。抗MTA2、Eotaxin-1、CCR3、p-ERK1/2、t-ERK1/2、MMP-3和β-actin的一級抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology。辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗購自英國Abcam。通用型IHC試劑盒購自成都正能生物技術有限責任公司。Lipofectamine 2000購自美國Life Technologies。GoScript RT Mix、GoTaq Green Master Mix、SYBR Green PCR Master Mix購自美國Promega。Transwells購自美國Corning。Matrigel購自美國BD Biosciences。裂解緩沖液購自德國Roche。BCA試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。ECL試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 研究對象 收集2018年1月～2020年6月空軍軍醫大學第一附屬醫院收治的50例前列腺癌組織及配對癌旁組織樣本用于免疫組織化學分析。患者術前均未進行治療。納入標準：①經病理診斷確診為原發性前列腺癌。②患者知情同意。③收集樣本前3個月內患者未進行藥物治療。④患者無心腦血管疾病、精神障礙、免疫系統疾病等。排除標準：①合并其他嚴重疾病或近期具有藥物治療史的患者。②非原發性前列腺癌患者。③未簽訂知情同意書的患者。本研究已獲得本院倫理審查委員會批準(倫理審批號：201801120008)，所有受試者均知情同意。

1.3 免疫組化染色檢測MTA2蛋白表達水平 組織切片在室溫下用二甲苯浸泡兩次(10 min)來脫蠟，并使用分級乙醇(100%, 2 min; 100%, 2 min; 95%, 2 min; 90%, 2 min; 80%, 2 min; 70%, 2 min)復水，隨后用蒸餾水沖洗。0.01 M檸檬酸鹽緩沖溶液用于抗原修復，微波加熱至沸騰3 min，冷卻至室溫，然后與PBS孵育15 min。免疫組化染色采用通用型IHC試劑盒，包括內源性過氧化物酶封閉液、血清、二抗、鏈霉親和素過氧化物酶和DAB顯色液。組織切片加入50 μL過氧化物酶阻斷液阻斷內源性過氧化物酶活性，室溫孵育15 min后，用PBS漂洗3次，每次3 min。先用山羊血清封閉30 min，然后將切片與MTA2抗體(1∶100)在4℃孵育過夜，用PBS清洗3次，每次10 min，然后用親和素偶聯的二抗在室溫下孵育30 min。經PBS洗滌后，將切片在50 μL鏈霉親和素過氧化物酶溶液中室溫孵育15 min，再用100 μL DAB室溫浸泡2 min。用光學顯微鏡觀察MTA2蛋白表達的變化。顯微鏡下觀察5個代表性區域(放大倍數為400×)，計數陽性染色區域的細胞數量，MTA2在細胞質和細胞核染色均為陽性。根據染色強度和染色細胞百分比，半定量評價MTA2在每個樣本中的表達水平。對每個標本進行染色強度評分(陰性=0，弱陽性=1，中等陽性=2，強陽性=3)和染色百分比評分(0～10%=1，11%～50%=2，50%～75%=3，75%～100%=4)。將強度和百分比相加，計算每個患者的染色評分。根據MTA2蛋白的表達將50例樣本分為兩組，染色評分≥4為高表達組(n=36例)，<4為低表達組(n=14例)[5]。

1.4 細胞培養及shRNA轉染 人前列腺癌細胞系(PC-3)購自美國ATCC。PC-3細胞用含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的RPMI-1640培養基培養(37℃, 5% CO2)。shMTA2 (MTA2-shRNA-pLKO.1)和shNC (Luc-shRNA-pLKO.1)質粒均由上海吉凱公司合成。MTA2靶序列為5′-AGGGAGTGAGGA GTGAATTAA-3′。轉染MTA2-shRNA-pLKO.1的細胞作為shMTA2組，轉染Luc-shRNA-pLKO.1的細胞作為shNC組，未轉染的細胞作為空白對照組(Control組)。采用Lipofectamine 2000進行轉染，將質粒和Lipofectamine 2000用Opti-MEM稀釋，然后按照1∶1的比例混合，室溫靜置15 min 后，加入鋪板后的PC-3細胞中轉染細胞24 h。通過qRT-PCR和Western blot驗證轉染效率。

1.5 qRT-PCR檢測MTA2的mRNA表達水平 使用TRIzol提取細胞總RNA。使用GoScript RT Mix將RNA (1 g)反轉錄為cDNA。使用GoTaq Green Master Mix進行RT-PCR。使用SYBR Green PCR Master Mix在美國Applied Biosystems STEP One Plus實時熒光定量PCR系統上進行PCR。RT-PCR引物為MTA2(正向：5′-GTTCTGGCAATACGG CGAGT-3′，反向：5′-CTTCGGCTGAATGCAAAG A-3′)和β-actin (正向：5′-ACTGGAACGGTGAAG GTGAC-3′，反向：5′-AGAGAAGTGGGGTGCTT TT-3′)。內參對照為β-actin。PCR反應條件為95℃預變性30 s，95℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸90 s，72℃延伸10 min。

1.6 細胞活力檢測 將shNC和shMTA2細胞以2×104個/孔的密度接種到24孔板中，分別培養48 h，根據制造商的說明，用MTT試劑檢測細胞活力。使用BIO-TEK酶標儀檢測570 nm處的吸光度。所有實驗做6個重復。

1.7 體外細胞遷移和侵襲分析 使用24孔Transwells (孔徑為8 μm)進行體外遷移分析。上室加入50 μL無血清培養液和細胞(2×104細胞/孔)，下室加入35 μL含10%胎牛血清的培養液。37℃孵育24 h后，除去上室中的未遷移細胞，膜下表面用95%甲醇固定10 min，0.5%結晶紫染色30 min。然后在顯微鏡下對5個不同區域的細胞進行計數。上室預先用5%的Matrigel涂覆用于確定細胞的侵襲力。所有實驗做6個重復。

1.8 Western Blot檢測蛋白表達水平 將細胞在含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的裂解緩沖液中裂解，用BCA試劑盒測定蛋白質濃度。將蛋白質樣本在10% SDS-PAGE上分離并轉移至聚偏二氟乙烯膜。封閉后將膜與一抗MTA2(1∶1000稀釋)、Eotaxin-1(1∶2000稀釋)、CCR3(1∶3000稀釋)、p-ERK1/2(1∶1000稀釋)、t-ERK1/2(1∶1000稀釋)、MMP-3(1∶2000稀釋)和β-actin(1∶1000稀釋)在4℃下孵育過夜。然后與HRP標記的IgG二抗(1∶2000稀釋)在37℃孵育1 h。通過ECL試劑盒進行顯影。β-actin作為內部對照。所有實驗做6個重復。

1.9 統計學分析 采用SPSS 22.0軟件進行統計分析。計數數據采用卡方檢驗，計量數據采用t檢驗或單因素方差分析及Tukey事后檢驗。生存評估采用Kaplan-Meier法。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MTA2對前列腺癌預后的診斷價值 低表達組和高表達組兩組患者的年齡、Gleason評分和TNM評分差異無統計學意義(P>0.05)。低表達組患者中出現淋巴結轉移率為14.29%(2/14)，高表達組患者中出現淋巴結轉移率為52.78%(19/36)，兩組患者的淋巴結轉移情況比較差異有統計學意義(2=6.131，P=0.013)(見表1)。Kaplan-Meier生存分析結果顯示，低表達組和高表達組患者的生存時間差異有統計學意義，低表達組患者的生存時間更長(2=4.756，P=0.029)，見圖1。

表1 MTA2低表達和高表達患者的臨床參數

圖1 MTA2低表達和高表達患者的Kaplan-Meier生存分析

2.2 MTA2蛋白在前列腺癌組織中高表達 免疫組化染色結果顯示(見圖2A)，前列腺患者癌組織中MTA2的染色評分顯著高于癌旁組織(5.16±0.87vs2.34±0.39,t=9.221,P<0.001)。MTA2在細胞質和細胞核中均有表達，且病變程度越高，MTA2染色強度越高，見圖2B。

圖2 MTA2蛋白在前列腺癌組織中高表達

2.3 沉默MTA2可抑制前列腺癌細胞的生長 與空白對照組比較，shMTA2組PC-3細胞中MTA2 mRNA和蛋白水平顯著降低(P<0.001)。MTT實驗結果顯示，與空白對照組相比，shMTA2組的細胞活力降低了56.87%，差異均有統計學意義(P<0.001)。見圖3。

圖3 沉默MTA2對PC-3細胞活力的影響

2.4 沉默MTA2可抑制前列腺癌細胞的遷移和侵襲 Transwells實驗結果顯示，與空白對照組相比，shMTA2組的細胞遷移數量降低了65.80%，細胞侵襲數量降低了56.35%，差異有統計學意義(均P<0.001)，見圖4。

圖4 沉默MTA2對PC-3細胞遷移和侵襲的影響

2.5 沉默MTA2對前列腺癌細胞中Eotaxin-1/CCR3軸的影響 Western blot結果顯示，與空白對照組相比，shMTA2組的Eotaxin-1、CCR3、p-ERK1/2和MMP-3的蛋白相對表達量依次降低了76.03%、69.12%、72.32%和54.67%，差異有統計學意義(均P<0.001)；t-ERK1/2的蛋白相對表達量與空白對照組相比，差異無統計學意義(P>0.05)。見圖5。

圖5 沉默MTA2對PC-3細胞中Eotaxin-1/CCR3軸相關蛋白表達的影響

3 討論

目前，其他學者已經在幾種人類癌癥中觀察到MTA2過表達，并且MTA2的表達水平與腫瘤侵襲能力、轉移和不良預后相關[6]。在喉鱗狀細胞癌中，MTA2的高表達表達與淋巴結轉移、臨床分期和腫瘤分化程度相關[7]。MTA2在侵襲性肺癌中表達，其表達增加與預后不良相關[8]。在膀胱癌中，MTA2的高表達可增強T24細胞增殖、克隆形成、遷移及侵襲[9]。與這些研究一致，本研究觀察到前列腺癌組織中MTA2的表達高于癌旁組織。此外，MTA2的高表達與淋巴結轉移和患者的生存期顯著相關。因此， MTA2過表達有可能成為預測前列腺癌患者預后的致癌因子。

侵襲和轉移是癌細胞的特征，也是影響預后的關鍵因素。本研究發現沉默MTA2可抑制前列腺癌細胞的生長、遷移和侵襲能力。為了揭示MTA2調控前列腺癌細胞侵襲的分子機制，本研究檢測了PC-3細胞中基質金屬蛋白酶-3 (MMP-3)的表達變化。已知MMPs家族通過降解各種細胞外基質(ECM)參與癌細胞的侵襲性，MMPs降解細胞外基質是腫瘤侵襲和轉移的先決條件。MMP活性失調后，惡性細胞可以破壞細胞間連接、溶解細胞外基質、破壞基底膜、侵入血管并表現出遠處轉移[10-13]。例如，下調MMP-3的表達抑制了宮頸鱗癌細胞的侵襲[14]。本研究顯示，沉默MTA2下調了前列腺癌細胞中MMP-3的表達。此外，眾所周知，ERK通路在一系列腫瘤進展過程中發揮重要作用，如增殖、侵襲和轉移，并且，MMP-3的活性受到ERK通路的調節[15-16]。本研究中，沉默MTA2也下調了前列腺癌細胞中ERK1/2的活性，因此，MTA2對前列腺癌細胞侵襲的調控作用可能是由ERK1/2-MMP-3軸介導的。

趨化因子和受體網絡在組織修復、免疫調節或造血效應方面發揮作用，然而，它們也調節癌細胞的遷移和侵襲[17-20]。嗜酸性粒細胞趨化因子(Eotaxin)家族是一組歸巢相關的CC趨化細胞因子[21-23]。Eotaxin參與嗜酸性粒細胞和中性粒細胞等炎性細胞的募集。Eotaxin-1 (CCL11)在小鼠過敏性哮喘等多種炎癥性疾病中均過表達[24]。在腫瘤學領域，據報道Eotaxin-1是人非小細胞肺癌中表達異常[25]。Eotaxin-1主要通過CC趨化因子受體-3(CCR3)發揮作用[26]。Eotaxin-1和CCR3的相互作用已被證明調控多種癌細胞的存活和轉移性[27]。CCR3作為Eotaxin-1的主要受體，在膠質母細胞瘤中表達上調，并且與不良的總體生存期相關[28]。本研究顯示，沉默MTA2下調了前列腺癌細胞中Eotaxin-1和CCR3的表達。已知CCR3在淋巴瘤細胞中激活ERK通路[29]，Eotaxin-1對人軟骨細胞MMP-3的上調依賴于ERK1/2的激活[30]。Zhu等[31]研究表明，Eotaxin/CCR3軸促進前列腺癌的侵襲潛能，Eotaxin-1通過CCR3-ERK途徑上調MMP-3的表達，促進前列腺癌細胞的侵襲。結合本研究結果，推測在前列腺癌發展過程中，MTA2的異常上調可能通過激活Eotaxin-CCR3-ERK1/2-MMP-3軸促進了癌細胞的侵襲能力，而下調MTA2可能通過抑制該信號軸來抑制前列腺癌細胞的轉移。然而，在后續的實驗中還需要進一步驗證Eotaxin-CCR3-ERK1/2-MMP-3軸在介導MTA2致癌作用中的主要功能和權重。

4 結論

本研究結果提示，MTA2在前列腺癌組織中高表達并且與患者的淋巴結轉移和生存期相關。沉默MTA2降低了前列腺癌細胞的遷移和侵襲能力，并且抑制了Eotaxin-CCR3-ERK1/2-MMP-3軸的激活。