合生元制劑對阿爾茲海默病小鼠影響研究

張金鑫， 童亞楠， 郝珊瑚， 王治國， 張國旭

1.北部戰區總醫院 核醫學科，遼寧 沈陽 110016；2.中國醫科大學 北部戰區總醫院研究生培養基地，遼寧 沈陽 110016

阿爾茲海默病(Alzheimer′s disease，AD)又名老年性癡呆，是一類起病較隱蔽、但呈慢性加重的神經系統退行性疾病，是癡呆癥中最常見的一種類型。其病理特點主要是β-淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，Aβ)異常堆積形成炎性斑塊、Tau蛋白異常磷酸化形成纖維纏結，以及突觸受損、神經元大量喪失等。目前，AD發病率呈上升趨勢，但其發病機制尚不明確，且未發現具有顯著治療效果的藥物和方法[1-3]。隨著人口老齡化，AD將會帶來嚴重的醫療、社會及經濟問題[4]。因此，尋找能夠高效防治AD的藥物和方法已經成為研究熱點。腸道菌群是影響人體健康的關鍵因素，腸道菌群失衡可能引起AD發生[5]。合生元制劑是益生元和益生菌的結合，在調節菌群平衡方面，服用合生元制劑比單獨使用益生元或益生菌更有效[6-7]。本研究以APP/PS1癡呆小鼠為模型，觀察服用合生元制劑對其行為學的影響，以及小鼠腦內海馬和皮質區Aβ沉積情況，探討合生元制劑治療AD的作用機制?，F報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取24只APP/PS1癡呆小鼠，5月齡，雄性，體質量24～30 g；以及12只C57BL/6J野生小鼠，5月齡，雄性，體質量24～30 g。APP/PS1癡呆小鼠由雄性APP/PS1轉基因小鼠和雌性野生型C57BL/6J小鼠交配所得。種鼠購于北京華富康生物科技股份有限公司，飼養于北部戰區總醫院藥劑科動物房，所有小鼠自由進食水。本實驗已獲得北部戰區總醫院實驗動物倫理委員會批準[Y(2021)024號]。

1.2 儀器與試劑 Morris水迷宮，切片機，攤烤片機，4%動物組織固定液，PV二抗試劑盒，DAB顯色試劑盒，蘇木素染色液，二甲苯，PBS磷酸鹽酸緩沖液，無水乙醇，中性樹膠，生物安全柜，重組Anti-beta Amyloid抗體(Abcam公司，稀釋比例1∶100)，嗜酸乳桿菌(菌種編號LA-G80)，乳雙歧桿菌(菌種編號BL-G101)，低聚木糖(上海潤盈生物工程有限公司)。乳雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、低聚木糖制成凍干粉末，即合生元制劑。其中，含乳雙歧桿菌2.5×109cfu/ml，嗜酸乳桿菌2.5×109cfu/ml，低聚木糖0.5 g。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組及給藥 采用隨機分組的方式將APP/PS1癡呆小鼠分成兩組，對照組和治療組各12只；另將12只C57BL/6J小鼠作為空白組。所有動物適應性飼養1周后，治療組和對照組小鼠分別灌胃合生元制劑和低聚木糖，每次給藥劑量為0.5 ml/只，空白組小鼠灌胃等量的生理鹽水，每天3次，持續灌胃3個月。

1.3.2 Morris水迷宮實驗 給藥結束后第2天，采用Morris水迷宮觀察各組小鼠的記憶和空間學習能力。Morris水迷宮設備是由水下平臺、圓形水池、標志物、視頻采集系統及行為學分析系統組成。水池直徑100 cm、高60 cm，其中，水深35 cm，留出25 cm的邊緣放置提示方位用的標志物，分為4個象限(E、W、S、N)，平臺放置于西北象限的中心、水面以下1～2 cm。水中滴加白色素，水溫維持在20℃～22℃。按序將小鼠從4個象限放入水中，放置時小鼠面朝池壁，下水輕柔，每次游泳60 s，記下小鼠找到平臺所用的時間(逃逸潛伏期)和游泳軌跡。若小鼠在規定時間找到平臺則允許小鼠在平臺停留15 s；若小鼠在規定時間未找到平臺，引導小鼠找到平臺，并讓小鼠在平臺停留15 s。每只小鼠每天游泳4次，連續5 d。第5天訓練結束后，撤掉水下平臺，將各組小鼠從平臺所在象限的對側放入水中，讓其游泳60 s，記錄每只小鼠在規定時間內穿越平臺次數和目標象限停留時間。

1.3.3 腦組織取材及免疫組化檢測 Morris水迷宮實驗結束后，將所有小鼠脫頸處死，取出整個腦組織放入4%動物組織固定液中。將腦組織中的海馬及皮層組織進行石蠟包埋，用于免疫組化檢測，切片厚度為5 μm。檢測步驟：(1)脫蠟、水化。切片用二甲苯浸泡3次，每次10 min；不同濃度乙醇分別浸泡5 min，蒸餾水沖洗3次，每次2 min。(2)3%甲醇過氧化氫孵育15 min，PBS緩沖液沖洗。(3)高壓修復后將切片放入PBS緩沖液中。(4)切片上滴加一抗(重組Anti-beta Amyloid抗體)，4℃過夜，次日取出，PBS緩沖液沖洗3遍，每遍3 min。(5)切片上滴加二抗(生物素)，室溫下孵育15 min，PBS緩沖液沖洗3遍，每遍3 min；DAB顯色5～10 s，蒸餾水沖洗，終止顯色。(6)蘇木素復染，不同濃度乙醇脫水，二甲苯透明每10 min 2遍，隨后封片。(7)電子顯微鏡觀察，截取不同視野組織進行圖像分析，存檔。

1.4 統計學方法 采用SPSS 26.0統計學軟件對數據進行處理。Morris水迷宮數據采用GraphPad prism 8作圖，統計分析采用重復測量數據方差分析，兩兩比較采用Tukey檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 合生元制劑對APP/PS1癡呆小鼠學習和記憶能力的影響 空白組、對照組、治療組第5天Morris水迷宮實驗各組小鼠游泳運動軌跡見圖1。隨著訓練天數的增加，各組小鼠找到平臺的時間逐漸縮短，但對照組小鼠進步不明顯；與空白組比較，在實驗的第3、4、5天時，對照組逃逸潛伏期顯著延長，差異有統計學意義(P<0.05)；與對照組比較，在實驗的第4、5天時，治療組逃逸潛伏期顯著縮短，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。與空白組比較，對照組穿越平臺次數減少，目標象限停留時間縮短，差異有統計學意義(P<0.05)；與對照組比較，治療組穿越平臺次數增加，目標象限停留時間延長，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3～4。

圖1 第5天Morris水迷宮實驗各組小鼠游泳軌跡比較 圖2 Morris水迷宮實驗各組小鼠逃逸潛伏期比較

圖3 各組小鼠穿越平臺次數比較 圖4 各組小鼠目標象限停留時間比較

2.2 合生元制劑對APP/PS1癡呆小鼠腦內海馬及皮質區Aβ表達的影響 腦組織免疫組化檢測結果顯示，黃色斑塊為陽性表達(黑色箭頭示)。與空白組比較，對照組小鼠腦內海馬及皮質區Aβ斑塊表達增多；與對照組比較，治療組小鼠腦內海馬及皮質區Aβ斑塊表達減少。見圖5～6。與空白組比較，對照組腦內海馬及皮質區平均光密度增加，差異有統計學意義(P<0.05)；與對照組比較，治療組腦內海馬及皮質區平均光密度降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖7～8。

圖5 各組小鼠腦內海馬區Aβ表達情況(400倍，黑色箭頭所指為Aβ斑塊沉積)

圖6 各組小鼠腦內皮質區Aβ表達情況(400倍，黑色箭頭所指為Aβ斑塊沉積)

圖7 各組小鼠腦內海馬區Aβ平均光密度比較 圖8 各組小鼠腦內皮質區Aβ平均光密度比較

3 討論

Morris水迷宮由英國心理學家莫里斯于1981年首次提出，主要用于評定嚙齒類動物的記憶和空間學習能力[8]。Morris水迷宮利用嚙齒類動物天生會水而又怕水的特點作為驅動力，強迫動物搜尋水下隱藏的平臺，學會利用周圍參照物與水下平臺的關系，強化其空間探索和認知能力，是目前AD動物模型研究中使用最為頻繁的行為學檢測方法之一[9]。Morris水迷宮一般分為隱匿平臺實驗和空間探索實驗兩個部分。隱匿平臺實驗的目的是檢測觀察對象學習能力的大小，觀測指標主要包括潛伏期、游泳軌跡、游泳速度、游泳距離及探索策略等；而空間探索實驗的目的是檢測觀察對象空間記憶的維持能力，觀測指標主要包括穿越平臺次數、目標象限停留時間、游泳總距離等[10]。Morris水迷宮在大量嚙齒類動物中的廣泛應用證實了其有效性和可靠性[11-13]。

本研究主要以逃逸潛伏期評定各組小鼠的空間學習能力，以穿越平臺次數和目標象限停留時間評定各組小鼠的空間記憶能力。Morris水迷宮實驗結果顯示：(1)與空白組比較，在實驗的第3、4、5天時，對照組逃逸潛伏期顯著延長，差異有統計學意義(P<0.05)；與對照組比較，在實驗的第4、5天時，治療組逃逸潛伏期顯著縮短，差異有統計學意義(P<0.05)。(2)與空白組比較，對照組穿越平臺次數減少，目標象限停留時間縮短，差異有統計學意義(P<0.05)；與對照組比較，治療組穿越平臺次數增加，目標象限停留時間延長，差異有統計學意義(P<0.05)。上述結果提示，APP/PS1癡呆小鼠存在明顯的記憶和空間學習障礙，而合生元制劑可有效提高小鼠的記憶和空間學習能力，改善其認知功能損傷，延緩AD進程。免疫組化檢測可分析合生元制劑干預后AD小鼠行為學改變的原因，結果顯示：(1)與空白組比較，對照組小鼠腦內海馬及皮質區Aβ斑塊表達增多；與對照組比較，治療組小鼠腦內海馬及皮質區Aβ斑塊表達減少。(2)與空白組比較，對照組腦內海馬及皮質區平均光密度增加，差異有統計學意義(P<0.05)；與對照組比較，治療組腦內海馬及皮質區平均光密度降低，差異有統計學意義(P<0.05)。這說明，APP/PS1癡呆小鼠腦內海馬及皮質區Aβ沉積多，符合AD小鼠的病理變化，且合生元制劑可降低APP/PS1癡呆小鼠腦內海馬及皮質區的Aβ沉積。

綜上所述，合生元制劑可有效降低APP/PS1癡呆小鼠腦內海馬及皮質區Aβ沉積，顯著增強小鼠的記憶和空間學習能力，改善認知功能損傷，從而延緩AD進程，為AD的防治提供了新的方向，但具體作用機理尚需進一步研究。