發酵劑對牦牛乳硬質干酪成熟過程中生物胺的影響

宋雪梅，宋國順，梁琪*，張炎

1(甘肅農業大學 食品科學與工程學院，甘肅 蘭州，730070)2(甘肅省功能乳品工程實驗室，甘肅 蘭州，730070)

全球每年大約35%牛乳用于干酪生產，年產量約1 900 萬t。硬質干酪是主要干酪品種，為了獲得良好食用品質，大部分需經歷不同成熟期。蛋白質降解是干酪成熟過程中重要的生化反應之一，其蛋白質在凝乳酶、纖維溶酶、微生物蛋白酶、肽酶等作用下，逐步降解成各種多肽和氨基酸。氨基酸在干酪中氨基酸脫羧酶存在情況下，經脫羧產生生物胺。

生物胺是氨中1個、2個或3個氫被脂肪基團、芳香基團或雜環烴基基團取代的堿性、含氮低分子質量有機化合物，作為生物體正常生理成分，在活生物細胞中具有重要生理功能[1]。然而，當人體攝入過多時，將嚴重損害機體健康。大量組胺攝入能引起人呼吸窘迫和心悸。酪胺能夠在單胺氧化酶抑制劑藥物治療病人身上引發高血壓，也能在敏感性群體中引發偏頭痛。干酪為生物胺形成提供了良好物質基礎和環境，因此，易于形成生物胺。

干酪中生物胺含量受原料乳質量、原料乳是否熱處理以及發酵劑[2-4]等眾多因素影響。干酪生產中常用發酵劑為嗜溫乳球菌、明串珠菌屬、乳桿菌和嗜熱鏈球菌等，除了快速發酵產酸使其pH值降低有助于凝乳外，也影響著成熟過程中蛋白質降解。干酪中氨基酸脫羧酶主要源于發酵劑或生產過程中雜菌[5]。乳酸菌是干酪中組胺和酪胺的主要產生者[6]。組胺源自乳酸鏈球菌和瑞士乳桿菌脫羧酶作用所產生的[7]。不同發酵劑對羊乳干酪中生物胺含量影響極顯著(P<0.01)[8]。不同發酵劑和脂肪含量的Dutch型半硬質干酪中主要生物胺為酪胺、組胺和腐胺[9]。乳酸菌產生物胺的能力具有菌株特異性，即使相同種屬乳酸菌，其產胺能力也不盡相同[10-12]。因此，科學、合理選擇發酵劑，有助于控制干酪中生物胺。

牦牛乳硬質干酪成熟期長，風味濃郁，營養價值高。研究發現不同發酵劑牦牛乳硬質干酪蛋白質降解具有差異[13]，但是蛋白質降解所產生的游離氨基酸變化是否影響生物胺產生和積累知之甚少。為此，本試驗以此為切入點，研究不同發酵劑對牦牛乳硬質干酪成熟過程中生物胺的影響，以期為牦牛乳硬質干酪生產中發酵劑選擇以及質量安全控制提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牦牛乳，天祝縣抓喜秀龍鄉；凝乳酶，北京多愛特生物科技有限公司；嗜熱發酵劑(嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌)、嗜溫發酵劑(乳酸乳球菌乳脂亞種、乳酸乳球菌乳酸亞種)和混合發酵劑(混合嗜熱發酵劑與嗜溫發酵劑質量比1∶1)，丹尼斯克公司；組胺二鹽酸鹽、2-苯乙胺鹽酸鹽、酪胺鹽酸鹽、腐胺二鹽酸鹽、尸胺二鹽酸鹽、丹磺酰氯、L-脯氨酸、1,7-二氨基庚烷等均為分析純，Sigma公司；乙腈(色譜純)、亮氨酸、水合茚三酮、氯化鎘、乙醚、碳酸氫鈉(分析純)等均為國產試劑。

1.2 儀器與設備

HWS26-電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學儀器有限公司；真空包裝機，溫州市大江真空包裝機械有限公司；TGL-20M高速臺式冷凍離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司；2998 PDA四元梯度超快速液相色譜儀，美國Waters公司；WD-12氮吹儀，杭州奧盛儀器有限公司；PHS-3C精密pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司；723型可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司。

1.3 試驗設計與方法

1.3.1 干酪制作和取樣

參考劉興龍等[14]的方法，適當修改后分別制作了3種不同發酵劑牦牛乳硬質干酪。主要操作要點如下：原料乳經63 ℃殺菌30 min后，冷卻到35 ℃，按照1%添加活化發酵劑于牛乳中，發酵1 h。再加入氯化鈣(0.3 g/L)緩慢攪拌均勻，10 min后，加入凝乳酶(0.67 g/L)，凝乳約1 h。再經過切割、排乳清、攪拌、加鹽、堆釀、壓榨等環節，形成乳凝塊，真空包裝。4 ℃下分別成熟1、2、3、4、5、6 個月，然后將不同成熟階段干酪貯藏在-80 ℃。成熟結束后，開展試驗。

1.3.2 pH 測定

參考JIN等[15]的方法,測定pH。稱取5 g干酪，加入10 mL蒸餾水混合、勻漿后，pH計測定。

1.3.3 游離氨基酸測定

參考FOLKERTSMA等[16]的方法，適當修改后測定。稱取一定量切碎干酪，按照1∶9(g∶mL)加入蒸餾水，研缽研碎，40 ℃下放置1 h。3 000 r/min下離心30 min后，再用快速濾紙過濾。取其過濾液30 μL,蒸餾水稀釋到1 mL，加入鎘-茚三酮溶液2 mL，84 ℃反應5 min。冷卻后，507 nm處測定吸光度。以亮氨酸為標準物，制作標準曲線，計算干酪中游離氨基酸含量。

1.3.4 生物胺測定

1.3.4.1 生物胺提取和衍生

參照INNOCENTE等[17]的方法,稱取5 g研磨均勻的干酪于試管中，加入0.1 mol/L鹽酸10 mL和1 mg/mL 1,7-二氨基庚烷100 μL，均質2 min后，干酪漿液在12 000 r/min、4 ℃下離心20 min。收集上清液，用同樣方法浸提殘余物，將浸提液混合后倒入容量瓶，用0.1 mol/L鹽酸定容到25 mL。

吸取1 mL溶液，加入0.5 mL飽和碳酸氫鈉和1 mL 50 mg/mL丹磺酰氯于帶有密封的試管中，渦旋振蕩30 s后，40 ℃反應60 min。之后，加入200 μLL-脯氨酸(100 mg/mL)，渦旋1 min，在室溫黑暗處反應15 min。再用1 mL乙醚萃取，4 ℃下離心3 min(3 000 r/min)。吸取上層有機溶液，重復離心后，將有機溶液層混合，用氮氣吹干。將殘留物溶解于1 mL乙腈中，經0.22 μm膜過濾后進行測定。以組胺、2-苯乙胺、酪胺、腐胺、尸胺為標準品，按照以上方法衍生，并制作標準曲線，計算干酪中各生物胺含量。

1.3.4.2 色譜條件

參照MORET等[18]的方法，利用HPLC適當調整后測定。色譜柱：Symmetry C18(5 μm，250 mm×4.6 mm)，柱溫30 ℃；流速1 mL/min；紫外檢測波長254 nm；進樣量10 μL；流動相A為水，流動相B為乙腈；梯度洗脫條件：0 min，65%B；1 min，65%B；10 min，80%B；14 min, 80%B；21 min，100%B；30 min，100%B。

1.4 數據統計分析

每個處理重復3次，結果用平均值±標準偏差表示，SPSS 19.0對數據進行方差和相關性分析，WPS Office作圖。

2 結果與分析

2.1 發酵劑對牦牛乳硬質干酪成熟過程中總生物胺的影響

3種發酵劑牦牛乳硬質干酪中各生物胺含量總和，為其總生物胺含量。其總生物胺在干酪成熟過程中的變化規律如圖1所示。

圖1 發酵劑對牦牛乳硬質干酪成熟過程中總生物胺含量的影響Fig.1 Effect of starter cultures on the total biogenic amines content during the ripening of cheese made from yak milk

由圖1可知，3種發酵劑干酪在1～3個月成熟過程中，其生物胺總量增加較快。經過第4個月緩慢成熟，進入5～6個月成熟階段時，又呈現較快增長態勢。成熟6個月時，嗜溫發酵劑干酪中總生物胺含量[(456.8±58.4)mg/kg]略高于嗜熱發酵劑干酪[(448.3±9.6)mg/kg]，但是兩者差異不顯著(P>0.05)。混合發酵劑干酪中生物胺總量[(293±24.5)mg/kg]僅占嗜溫發酵劑干酪的64.15%，顯著低于嗜熱、嗜溫發酵劑干酪中總生物胺含量(P<0.05)。方差分析顯示，發酵劑類型和成熟時間對干酪中生物胺總量影響顯著(P<0.05)。

2.2 發酵劑對牦牛乳硬質干酪成熟過程中2-苯乙胺的影響

由圖2可知，3種發酵劑牦牛乳硬質干酪在1～3個月和4～6個月成熟期間，其2-苯乙胺呈現較快增長趨勢。方差分析顯示，發酵劑類型對干酪中2-苯乙胺含量影響不顯著(P>0.05)，但是混合發酵劑干酪中2-苯乙胺含量整體相對較低。

圖2 發酵劑對牦牛乳硬質干酪成熟過程中2-苯乙胺含量的影響Fig.2 Effect of starter cultures on the 2-phenylethylamine content during the ripening of cheese made from yak milk

2.3 發酵劑對牦牛乳硬質干酪成熟過程中腐胺的影響

由圖3可知，嗜熱發酵劑牦牛乳硬質干酪在1～4個月成熟過程中，其腐胺增加緩慢，之后，呈現明顯增加趨勢。嗜溫、混合發酵劑干酪在1～3個月成熟過程中，其腐胺快速增加，之后增加緩慢。在1～2個月成熟過程中，嗜熱發酵劑干酪中腐胺含量顯著高于嗜溫、混合發酵劑干酪(P<0.05)。成熟6個月時，嗜熱、嗜溫發酵劑干酪腐胺含量分別達到最高，且嗜溫發酵劑干酪中腐胺高于嗜熱發酵劑干酪，但兩者差異不顯著(P>0.05)。混合發酵劑干酪中腐胺含量為嗜溫發酵劑干酪中腐胺的62.26%，顯著低于嗜熱和嗜溫發酵劑干酪(P<0.05)。本試驗所用嗜溫發酵劑由乳酸乳球菌乳酸亞種、乳酸乳球菌乳脂亞種組成，FLASAROV等[19]曾報道了以乳酸乳球菌乳脂亞種為發酵劑，成熟90 d的模擬Dutch型干酪中腐胺和酪胺含量分別達900、500 mg/kg，因此，嗜溫發酵劑牦牛乳硬質干酪中腐胺和酪胺較高與其發酵劑屬性有關。

圖3 發酵劑對牦牛乳硬質干酪成熟過程中腐胺含量的影響Fig.3 Effect of starter cultures on the putrescine content during the ripening of cheese made from yak milk

2.4 發酵劑對牦牛乳硬質干酪成熟過程中尸胺的影響

由圖4可知，混合發酵劑牦牛乳硬質干酪在1～3個月成熟過程中，未檢測出尸胺，在4～6個月成熟過程中，其呈現增加態勢,但是無顯著差異(P>0.05)。成熟4個月嗜熱發酵劑干酪中尸胺顯著高于嗜溫、混合發酵劑干酪(P<0.05)。嗜熱發酵劑干酪在4～6個月成熟過程中，其尸胺含量變化較小，而嗜溫發酵劑干酪中尸胺呈現急劇增加趨勢，GUARCELLO 等[20]發現尸胺含量與乳球菌之間具有正相關性。成熟6個月時，混合發酵劑干酪中尸胺最低，只有嗜溫發酵劑干酪中尸胺的0.37倍。

圖4 發酵劑對牦牛乳硬質干酪成熟過程中尸胺含量的影響Fig.4 Effect of starter cultures on the cadaverine content during the ripening of cheese made from yak milk

2.5 發酵劑對牦牛乳硬質干酪成熟過程中組胺的影響

由圖5可知，成熟1～3個月嗜溫發酵劑牦牛乳硬質干酪中未檢出組胺，成熟后期，組胺產生。在1～6個月成熟過程中，嗜熱發酵劑干酪中組胺最高，嗜溫發酵劑干酪次之,混合發酵劑干酪中未檢測出組胺，但是嗜熱發酵劑干酪中組胺最高含量[(20.8±7.9)mg/kg]遠低于美國食品藥品管理局規定的食品中組胺最大限值50 mg/kg。嗜熱鏈球菌屬的某些菌株具有產組胺能力[21]。酸性pH將誘導嗜熱鏈球菌組氨酸脫羧酶活性增強[22]。本試驗所用嗜熱發酵劑含有嗜熱鏈球菌，因此，嗜熱發酵劑牦牛乳硬質干酪中組胺較高。

圖5 發酵劑對牦牛乳硬質干酪成熟過程中組胺含量的影響Fig.5 Effect of starter cultures on the histamine content during the ripening of cheese made from yak milk

2.6 發酵劑對牦牛乳硬質干酪成熟過程中酪胺的影響

由圖6可知，牦牛乳硬質干酪在1～3個月成熟過程中，嗜熱、嗜溫和混合發酵劑干酪中酪胺呈現增加趨勢，且三者無顯著差異(P>0.05)。成熟5個月嗜溫、嗜熱發酵劑干酪中酪胺無顯著差異(P>0.05)，但是與混合發酵劑干酪具有顯著性差異(P<0.05)。成熟6個月時，嗜溫發酵劑干酪中酪胺含量[(92.9±6.7) mg/kg]顯著高于嗜熱、混合發酵劑干酪(P<0.05)。嗜溫、混合發酵劑均含有乳酸乳球菌。某些乳酸乳球菌菌株含有酪氨酸脫羧酶基因[23]，PINTADO等[24]發現乳球菌和酪胺之間具有較強相關性，因此，嗜溫、混合發酵劑牦牛乳硬質干酪出現了酪胺含量較高的現象。

圖6 發酵劑對牦牛乳硬質干酪成熟過程中酪胺含量的影響Fig.6 Effect of starter cultures on the tyramine content during the ripening of cheese made from yak milk

2.7 發酵劑對牦牛乳硬質干酪成熟過程中游離氨基酸的影響

乳酸菌在干酪成熟過程中由于自身所含肽酶和自溶度差異，以及生長繁殖過程中對氨基酸利用程度不同，使得干酪中游離氨基酸總量處于動態調整中。由圖7可知，牦牛乳硬質干酪在1～6個月成熟過程中，其游離氨基酸呈現增加趨勢。嗜熱發酵劑干酪中游離氨基酸含量最高，嗜溫發酵劑次之，混合發酵劑干酪中游離氨基酸含量最低。

圖7 發酵劑對牦牛乳硬質干酪成熟過程中游離氨基酸含量的影響Fig.7 Effect of starter cultures on the content of free amino acids during the ripening of cheese made from yak milk

2.8 發酵劑對牦牛乳硬質干酪成熟過程中pH的影響

pH通過調節氨基酸脫羧酶基因表達或者其活性影響生物胺形成與積累。從圖8可知，3種發酵劑牦牛乳硬質干酪pH變化不同，在1～3個月成熟過程中，嗜熱發酵劑干酪pH較高，嗜溫發酵劑干酪pH較低。但是在4～6個月成熟過程中，混合發酵劑干酪pH較高，而嗜熱、嗜溫發酵劑干酪pH較低，且相近。

圖8 發酵劑對牦牛乳硬質干酪成熟過程中pH的影響Fig.8 Effect of starter cultures on pH during the ripening of cheese made from yak milk

2.9 不同發酵劑牦牛乳硬質干酪中游離氨基酸和生物胺之間的相關性分析

對不同發酵劑牦牛乳硬質干酪中游離氨基酸和生物胺進行了相關性分析，結果見表1。

表1 牦牛乳硬質干酪中各生物胺和游離氨基酸相關性分析Table 1 Pearson correlation coefficients between the total free amino acid and biogenic amine content in the hard cheese made in yak milk

從表1可知，除了組胺之外，干酪中游離氨基酸與各生物胺呈極顯著正相關性(P<0.01)，說明游離氨基酸對生物胺形成具有重要作用。各生物胺之間也存在正相關性。腐胺和生物胺總量呈極顯著正關性(P<0.01)，其相關系數高達0.983，這與腐胺在3種發酵劑干酪中總生物胺含量占比較高有關。

3 討論

干酪生物胺是一定環境條件下，微生物氨基酸脫羧酶作用于游離氨基酸所形成。本試驗發現在1～6個月成熟過程中，牦牛乳硬質干酪中各生物胺含量整體呈現增加態勢，這與3種發酵劑牦牛乳硬質干酪中游離氨基酸含量增加相一致。乳桿菌屬、乳球菌屬、明串珠菌屬、鏈球菌屬的某些菌株具有產胺能力[25]，但是本試驗發現3種發酵劑牦牛乳硬質干酪中總生物胺含量遠低于TAYLOR推薦的安全劑量1 000 mg/kg[26]。組胺和酪胺是2種毒性相對高的生物胺，不同發酵劑牦牛乳硬質干酪中酪胺含量高于組胺。但3種發酵劑牦牛乳硬質干酪中酪胺含量未超過學者建議安全劑量100～800 mg/kg[27]。生物胺的產生是乳酸菌對環境pH較低的一種應激反應，混合發酵劑牦牛乳硬質干酪在成熟后期(4～6個月)pH較高，且混合發酵劑干酪中游離氨基酸含量也較低。另外，劉瑛等[28]報道嗜熱發酵劑和混合發酵劑牦牛乳硬質干酪中鹽含量較高，這對乳中某些具有產生物胺的外來菌如假單胞菌、腸桿菌、微球菌具有抑制作用。因此，混合發酵劑牦牛乳硬質干酪中生物胺含量相對較低。其他學者也報道了采用混合發酵劑如乳酸桿菌和葡萄球菌能夠抑制不同來源發酵食品中生物胺形成[29]。

除了3種發酵劑牦牛乳硬質干酪理化性質不同導致生物胺差異外，干酪所包含的復雜的微生物系統(包含發酵劑和非發酵劑)自身以及在干酪成熟過程中微生物生長繁殖代謝也發揮著重要作用。發酵劑通過產細菌素或者競爭性生長繁殖對一些低濃度革蘭氏陰性菌產生不同抑制[30]。乳酸菌在干酪成熟過程由于其理化性質改變導致自溶程度不同，釋放的肽酶也不同，而且由于氮代謝物阻遏效應的存在，微生物對各種氨基酸和亞氨基酸的同化效果也不同[31]，從而使得干酪中作為生物胺底物的游離氨基酸含量存在差異。另外，不同微生物種類決定了其產胺屬性，如GEZGINC等[21]發現嗜熱鏈球菌屬的某些菌株具有產組胺能力，PERIN等[23]發現某些乳酸乳球菌菌株含有酪氨酸脫羧酶基因，牛乳中污染菌革蘭氏陰性菌易于產組胺、腐胺和尸胺。不同發酵劑牦牛乳硬質干酪理化特性和所包含的微生物決定了其生物胺差異，但是3種發酵劑牦牛乳硬質干酪中生物胺差異形成的具體原因還有待于進一步深入研究。

4 結論

嗜熱、嗜溫發酵劑牦牛乳硬質干酪中檢測出2-苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺和酪胺，混合發酵劑干酪中檢測出2-苯乙胺、腐胺、尸胺和酪胺。各生物胺之間呈現正相關性。在1～6個月成熟過程中，干酪中各生物胺整體呈現增加態勢，嗜熱、嗜溫和混合發酵劑干酪中總生物胺最高含量分別為(448.3±9.6)、(456.8±58.4)和(293±24.5)mg/kg。嗜熱發酵劑干酪中組胺和嗜溫發酵劑干酪中酪胺最高，其最高含量分別為(20.8±7.9)、(92.9±6.7)mg/kg，混合發酵干酪中未檢測出組胺，酪胺含量次之，這為合理選擇發酵劑和控制干酪中生物胺形成提供了依據。