富含γ-氨基丁酸黑豆芽益生菌發酵酸乳研究

付艷嬌 王銀雁 劉 巖 肖佳寧 劉國琴 廖斯琪 國立東

（黑龍江中醫藥大學藥學院，黑龍江哈爾濱 150040）

γ-氨基丁酸（GABA）是一種抑制性神經遞質，具有促進睡眠、降血壓、改善抑郁等功效，是天然存在的非蛋白質類氨基酸，其廣泛存在于動、植物體內，甚至是某些微生物的代謝產物。發芽處理已成為植物富集γ-氨基丁酸的一種有效手段[1]。黑豆因種皮黑色而得名，屬于藥食同源類的豆科植物，含有豐富的營養成分，其在萌發后主要活性物質會明顯增加，包括γ-氨基丁酸[2]。因此，黑豆發芽也具有富集γ-氨基丁酸的作用。此外，乳酸菌作為益生菌的重要來源，因其安全性高且具有益生作用而備受關注，包括降膽固醇[3]、降血壓[4]、抗抑郁[5]等。益生菌發酵產品近年來受到消費者普遍青睞，尤其是益生菌發酵植物基產品逐漸成為熱點。課題組前期從傳統自然發酵酸菜中分離篩選出一株性狀優良的植物乳桿菌，其可降膽固醇、產γ-氨基丁酸，且對酸和膽汁表現出了良好耐受性[6]。鑒于以上考慮，本文考察了發芽對黑豆中γ-氨基丁酸含量的影響，并以富含γ-氨基丁酸的黑豆芽乳為基質，利用植物乳桿菌發酵制備黑豆芽酸乳，旨在為黑豆芽基益生菌發酵酸乳產品的開發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗樣品為黑豆，產地為黑龍江哈爾濱；植物乳桿菌HUCM115，分離自傳統自然發酵東北酸菜。

試驗儀器設備包括分析天平、pH計，由梅特勒-托利多集團生產；超凈工作臺，由蘇州凈化設備有限公司生產；離心機，由湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司生產；紫外可見分光光度計，由上海光譜儀器有限公司生產；生化培養箱，由上海躍進醫療器械有限公司生產；全自動家用豆漿機，由九陽股份有限公司生產。

1.2 試驗方法

1.2.1 乳酸菌培養與活化。改良MRS培養基參照文獻[7]方法配制。植物乳桿菌HUCM115經改良MRS液體培養基于37℃培養24 h，如此傳代2～3代，以恢復菌種活力。

1.2.2 黑豆發芽。挑選無破損、大小均一且色澤均勻的黑豆籽粒，清水漂洗后，用0.5%次氯酸鈉溶液浸泡7 min，再用無菌水漂洗并在室溫下浸泡4 h。隨后于30℃條件下發芽5 d，每隔12 h無菌水漂洗1次，并記錄每天發芽情況。

1.2.3 黑豆芽乳制備及GABA含量測定。分別取發芽 0、1、2、3、4、5 d 的黑豆芽， 調整豆芽乳干物質質量分數為10%，用豆漿機進行打漿處理，并經200目篩網過濾，得黑豆芽乳。參照文獻[8]用70%乙醇提取GABA，同時用 Berthelot反應分別測定發芽 0、1、2、3、4、5 d 黑豆芽乳中 GABA 含量。以 0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 g/L 濃度的 GABA 標準溶液制作標準曲線。在645 nm處測定溶液吸光度，以吸光度為縱坐標、GABA濃度為橫坐標，繪制標準曲線（圖1）。GABA標準曲線回歸方程為y=1.957 5x-0.017 4，R2=0.999 4，具有良好的線性關系。

1.2.4 黑豆芽酸乳制備。分別取不同發芽天數的黑豆芽乳，經110℃滅菌10 min，冷卻后得無菌黑豆芽乳。隨后，取已活化的植物乳桿菌HUCM115發酵液，經4 000 r/min離心10 min，獲得菌泥，再用無菌純凈水重懸，洗滌2次，按1%接種量接種至無菌黑豆芽乳中，37℃恒溫培養24 h，觀察凝乳狀態及風味變化。

1.2.5 培養時間對黑豆芽酸乳的影響。取發芽2 d的無菌黑豆芽乳，植物乳桿菌HUCM115按1%接種量進行接種，37℃恒溫培養24 h，以黑豆芽酸乳的活菌數和pH值為監測指標，考察不同培養時間對黑豆芽酸乳的影響。活菌數測定采用平板菌落計數法。

2 結果與分析

2.1 發芽時間對黑豆芽感官性狀的影響

隨著發芽時間的延長，黑豆芽的芽長逐漸增加。發芽處理1 d只有少數黑豆破皮出芽；發芽處理2 d時，黑豆大量出芽，表皮開始脫落；從第4天開始，黑豆芽前端開始逐漸變黃。打漿并過濾得到的黑豆芽乳，隨著發芽天數的增加，其豆芽味及豆腥味也隨之增加，從第4天開始出現少量異味。

2.2 發芽時間對黑豆芽乳中GABA含量的影響

按照1.2.3的方法分別測定不同發芽時間黑豆芽乳中的GABA含量，結果如圖2所示。隨著發芽天數的增加，黑豆芽乳中的GABA含量明顯升高，直至發芽第3天時達到最高，GABA濃度從初始0.43 g/L增加到第3天0.56 g/L，GABA濃度提高了30.2%，從第4天開始GABA含量出現明顯下降趨勢。

2.3 發芽時間對黑豆芽酸乳的影響

基于黑豆芽乳風味和GABA含量的考慮，最終以發芽0、1、2、3 d的黑豆芽乳為發酵基質，按1.2.4的方法接種植物乳桿菌HUCM115菌株進行發酵培養，從而比較不同發芽天數黑豆制作的黑豆芽酸乳在品質上的差異。結果顯示，植物乳桿菌HUCM115按1%接種量接種至不同發芽天數的黑豆芽乳中，37℃培養24 h，均能使其凝乳，具有明顯的酸味，并伴有乳清析出。其中，發芽3 d的黑豆芽酸乳青芽味相對明顯，故選取無明顯豆芽味和豆腥味的發芽2 d黑豆芽做進一步研究，其GABA濃度較初始濃度可提高20.9%。

2.4 培養時間對黑豆芽酸乳的影響

2.4.1 培養時間對黑豆芽酸乳活菌數的影響。活菌數是益生菌發酵產品很重要的評價指標之一，黑豆芽酸乳中活菌數的變化情況如圖3所示。隨培養時間的延長，黑豆芽酸乳中活菌數逐漸升高，10 h時活菌數最高，達到3.7×109CFU/mL，隨后活菌數出現下降趨勢。

2.4.2 培養時間對黑豆芽酸乳pH值的影響。pH值大小直接反映了黑豆芽酸乳的酸味程度，隨著發酵時間延長，黑豆芽酸乳pH值變化規律如圖4所示。黑豆芽酸乳初始pH值為6.4，經植物乳桿菌HUCM115發酵后，pH值逐漸降低，至10 h時pH值降到最低，為4.2，之后趨于平穩。pH值最低點與活菌數最高點出現的時間一致。

3 結論與討論

黑豆具有很多重要的生理功能，如抗氧化[9]、抗肥胖[10]、保肝[11]等。研究表明，黑豆在萌芽后多種營養成分含量會出現不同程度的增加，如VC、葉綠素、異黃酮、蛋白質等[12]。本研究對黑豆發芽5 d內γ-氨基丁酸含量進行了測定，發現第3天含量最高而后降低，然而鮑會梅等[12]研究發現，黑豆γ-氨基丁酸含量在發芽7 d內一直處于上升趨勢，這與文中得到的結果不完全一致。文中以一株對酸和膽汁具有一定耐受能力且可降膽固醇的植物乳桿菌HUCM115為發酵劑菌種，制備了益生菌發酵黑豆芽酸乳，該產品能否在體內發揮相應的益生作用仍有待于進一步證實。此外，Lee等[13]利用戊糖乳桿菌固態發酵發芽黑豆，發現總多酚、黃豆苷元、黃豆黃素和染料木黃酮含量明顯提高，并可減輕DNFB誘導的C57BL/6N小鼠遲發型超敏反應，植物乳桿菌HUCM115發酵黑豆芽后能否促進上述活性物質生成，并展現出相應的功能性，仍有待于進一步深入研究。