柳州市柑橘黃龍病發生情況調查

歐陽雪 沈峰杰 蒙菲菲 陳柳裕 黃祖元 莫榮清 韋俊平

（1廣西壯族自治區農業科學院柳州分院/柳州市農業科學研究中心，廣西柳州 545003；2柳州市柳南區現代農業產業農服中心，廣西柳州 545007；3融水苗族自治縣農業農村局，廣西融水 545300；4柳州市柳江區三都鎮農業技術推廣站，廣西柳州 545100）

中國是最大的柑橘生產國，廣西是我國柑橘主產省份之一，擁有悠久的栽培歷史[1-2]。近年來，廣西柑橘產業不斷發展壯大，2015—2019年廣西柑橘產量連續5年居全國之首，成為我國柑橘產量最大的主產區[3]。柳州市作為廣西柑橘產業主產區之一，全市栽培有砂糖橘、柳城蜜橘、沃柑等幾十個品種。隨著農業種植結構的深入調整，柑橘產量在柳州市水果產量中比重逐年增加。據統計，2020年柳州市柑橘種植面積達到6.4萬hm2，產量達到91萬t，占全市水果產量的78%。柑橘已經成為柳州市農村經濟發展的主導農業產業，是農民增收、脫貧致富的重要手段。

柳州市柑橘產業規模不斷發展的同時，也面臨諸多不利因素的制約，其中柑橘黃龍病是威脅柑橘產業健康發展的首要因素[1]。據了解，廣西是柑橘黃龍病的老發生區，每年因柑橘黃龍病造成減產約為50萬t，損失約10億元[4-5]。柑橘黃龍病是一種由僅能寄生于韌皮部篩管組織內的革蘭氏陰性細菌——韌皮部桿菌屬類細菌引起的檢疫性病害，對柑橘生產具有毀滅性危害，是制約柑橘生產的“癌癥”[6-8]。同時，果農對柑橘黃龍病防控意識相對薄弱，且受柑橘市場價格因素影響，導致防控黃龍病投入少，部分果園失管等現象頻發，加速了柑橘黃龍病在柳州市的蔓延，造成了巨大的經濟損失，嚴重制約著柳州市柑橘產業發展。

當前還沒有抗病品種和防治黃龍病的有效藥劑，對染病植株只能砍伐清除。因此，黃龍病檢測對柳州市柑橘產區黃龍病日常監測和柑橘產業健康發展尤為重要。黃龍病檢測通常采用常規PCR檢測技術，其特點是成本低、簡便、靈敏、準確，適合柑橘黃龍病大規模監測[9]。為及時掌握柳州市柑橘黃龍病發生情況，遏制柑橘黃龍病的發生與傳播，筆者從全市柑橘產區正常管理的果園中采用五點取樣法采集柑橘樣品，通過常規PCR檢測技術，分析柳州市柑橘黃龍病發生情況。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

柳州市五縣（柳城縣、鹿寨縣、融安縣、融水苗族自治縣和三江侗族自治縣）各選取3個鄉鎮，每個鄉鎮抽取3個柑橘園，市郊五區（柳北區、柳南區、魚峰區、柳東新區和柳江區）各抽取3個柑橘園，每個果園均采用五點取樣法隨機選取10份柑橘樣品，每份樣品取自同一株柑橘樹。全市累計抽樣60個柑橘園，共采集600份柑橘樣品（表1）。將采集的柑橘樣品按來源分類整理并做好標記，放入4～5℃冰箱保存備用。

表1 柑橘采集樣本來源分布

1.2 樣品DNA提取

使用MiniBEST植物基因組DNA提取試劑盒（寶日醫生技術（北京）有限公司）進行DNA提取，提取方法如下：取6～8張柑橘葉片中脈剪碎，稱取0.1 g中脈碎末置于2 mL離心管中，放入5 mm研磨珠；加入 500 μL 的 Buffer HS I和 10 μL 的 50×DTT Buffer溶液，隨后離心管插入-20℃冷凍研磨盒中，使用全自動樣品快速研磨儀研磨，頻率65 Hz，研磨時間為200 s，中斷 10 s，重復運行 3 次；吸取 10 μL RNase A（10 mg/mL）放入2 mL離心管中振蕩混勻，隨后離心管放入水浴鍋中（56 ℃）10 min；加 62.5 μL 的 Buffer KAC，振蕩混勻后放入冰盒中5 min，12 000 r/min離心5 min；取350 mL上清液和350 mL Buffer GB于1.5 mL離心管中振蕩混勻，混合溶液放入1.5 mL離心管；把旋轉柱插入收集管中，將1.5 mL離心管混合液倒入旋轉柱中，12 000 r/min離心1 min，棄濾液；吸取500 μL的Buffer WA放入旋轉柱，12 000 r/min離心 1 min，棄濾液；取700 μL的Buffer WB放入旋轉柱中，12 000 r/min離心1 min，棄濾液；重復上一個步驟；將收集管離心（12 000 r/min）2 min，棄收集管；將旋轉柱放于新的1.5 mL離心管上，于轉柱中加 40 μL Elution Buffer，靜置 5 min；最后 12 000 r/min離心2 min，洗脫DNA，棄旋轉柱，將裝有DNA溶液的1.5 mL離心管放于-20℃冰箱中保存。

1.3 常規PCR反應體系

采用常規PCR技術進行檢測，設計特異性引物OI1/OI2c，根據柑橘黃龍病菌亞洲株系16 S rDNA基因序列，引物序列OI1為5′-GCGCGTATGCAATACG AGCGGCA-3′，OI2c 為 5′-GCCTCGCGACTTCGCAAC CCAT-3′，由生工生物工程（上海）有限公司合成，擴增目的核酸片段長度1 167 bp[10]。以黃龍病陽性樣品的DNA為陽性對照、柑橘無病毒苗木樣品為陰性對照（通過常規PCR和熒光定量PCR鑒定確認），以ddH2O為空白對照，通過常規PCR技術進行檢測。

PCR 擴增體系 25 μL，即 10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，上游引物、下游引物各 1 μL，Taq DNA 聚合酶 0.2 μL，DNA 模板 2 μL，ddH2O 補至 25 μL。 反應程序為94℃持續5 min，94℃持續45 s，68℃持續45 s，72℃持續 1 min，35個循環，72℃持續 10 min，PCR產物保存于4℃。

1.4 PCR產物電泳

稱取1.2 g瓊脂糖加入100 mL 1×TBE試劑中振蕩混勻，放入微波爐中加熱煮沸至溶液透明，加入轉子，吸取 10 μL Super GelRed Nucleic Acid Gel Stain 10 000×in water，然后用磁力攪拌儀攪拌 6 min，倒入脫膠靜止30min。向PCR產物中加入5μL6×Loading Buffer渦旋離心，隨后取8 μL PCR產物點入1%瓊脂糖凝膠孔中，凝膠放入1×TBE緩沖液中電泳，電壓150 V，電泳45 min。電泳結束后，使用凝膠成像儀觀察結果。

2 結果與分析

由圖1可以看出：陰性對照和ddH2O空白對照在1 167 bp位置處沒有擴增出條帶；部分樣品在1 167 bp位置擴增出特異性條帶，與陽性對照條帶一致，說明樣品感染了黃龍病；其余樣品與陰性對照和ddH2O空白對照一樣沒有顯現條帶，說明樣品未檢測出感染黃龍病。

由表2可知，從60個果園采集的600份樣品中檢測到24個樣品擴增出與陽性對照一致的條帶，陽性檢出率為4.00%。柳州市市郊五區及五縣柑橘樣品中均有樣品檢測結果呈陽性，其中：市郊五區樣品陽性率為1.33%，感染黃龍病情況相對較輕；五縣當中，鹿寨縣樣品陽性率為1.11%，感染黃龍病情況相對較輕；柳城縣、三江侗族自治縣樣品陽性率分別為8.89%、6.67%，感染黃龍病情況相對較重。

表2 各柑橘園黃龍病樣品PCR檢測情況

3 結論與討論

柑橘黃龍病在柳州市市郊、五縣都有不同程度的發生，其中柳城縣是柳州市柑橘主產區，也是黃龍病老病區，柑橘黃龍病感染率較高，其他各縣區黃龍病感染情況也不可忽視。黃龍病的發生情況受多種因素影響，總體來說，柑橘產業的發展水平與管理水平、病蟲害治理強度成明顯的正相關關系。筆者通過調查檢測發現，管理水平相對較高的柑橘園陽性檢出率較低，甚至沒有檢測出陽性。這些果園在管理上都有相同的特點：首先，果農對黃龍病都有較強的防控意識，選址建園時選擇周圍少或無黃龍病感染源的地方，以種植柑橘無病毒苗木為主；其次，果農注重防治木虱等病蟲害，及時清理病樹，補種健康大苗；再次，果農積極學習柑橘黃龍病防控知識，優化防控能力。

柳州市近年來重視柑橘黃龍病防控工作，認真學習貫徹落實《廣西壯族自治區柑橘黃龍病防控規定》，建立柑橘無病毒苗木繁育體系，培育健康苗木，從源頭上杜絕黃龍病的發生；開展黃龍病普查工作，重點防治木虱；實施柑橘黃龍病綜合防控體系，建立柑橘黃龍病防控示范區，注重黃龍病聯防聯控和統防統治等措施，在遏制黃龍病傳播方面取得了一定成效。

鑒于目前柳州市柑橘黃龍病的發生情況，全市仍要加大柑橘黃龍病防控力度，尤其要對柳州市柑橘主產區黃龍病發生情況進行實時監測，完善柑橘黃龍病綜合防控體系，緊抓聯防聯控、統防統治工作，依靠行政和社會管理共同推進柑橘黃龍病防控治理，構建可持續發展的柑橘產業。