防風藥材與飲片指紋圖譜對比研究

瞿昊宇，謝夢洲，陳光宇*，何 群

(1.湖南中醫藥大學 中醫學院，湖南 長沙 410208；2.湖南省藥食同源功能性食品工程技術研究中心，湖南 長沙 410208；3.中醫診斷學湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410208；4.中醫心肺病證辨證與藥膳食療重點研究室，湖南 長沙 410208；5.湖南中醫藥大學 信息科學與工程學院，湖南 長沙 410208)

防風為傘形科植物防風Saposhnikoviadivaricata(Turcz.)Schischk.的干燥根，一般于春、秋兩季采挖未抽花莖植株的根，除去須根和泥沙曬干制成[1]。防風主產于中國黑龍江、吉寧、遼寧、內蒙古、河北、寧夏、甘肅、陜西、山西、山東等省區[2]，生長于草原、丘陵、多礫石山坡，根供藥用，是中國東北地區著名藥材之一[3]，有祛風解表、勝濕止痛、止痙的功效，用于感冒頭痛、風濕痹痛、風疹瘙癢、破傷風等癥，其味辛、甘，微溫[4]，收載于2020版《中國藥典》一部156頁“防風藥材及飲片”項下，但只記載了其性狀、鑒別、檢查、含量測定等，未收載指紋圖譜檢測。防風主要有效成分為升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷，具有較好的解熱、鎮痛、抗炎、消腫等活性作用[5]。由于受天氣、土壤、環境、產地、采收時間、采收方法的影響，防風藥材的成分存在差異，僅從已有的檢測項目無法控制藥材質量[6，7]，研究其單體成分并不能洞悉防風藥材功效的全貌，從而影響防風藥材及飲片的質量控制及質量評價[8-10]。為確保防風藥材及飲片的質量與療效，避免摻入長蛾子的防風，指導防風藥材產地的加工炮制，本研究考察與評價了從防風藥材-飲片的量值傳遞率、指紋特征變化，并建立了防風藥材及飲片指紋圖譜的分析方法，通過方法學論證，考察了防風炮制前后的差異，為指導防風藥材產地加工炮制，確保防風飲片的質量與療效提供了依據。

1 儀器與藥材

1.1 儀器

Ultimate 3000高效液相色譜系統(賽默飛世爾科技(中國)有限公司，包括G1316A四元梯度泵、G1313A標準型自動進樣器、G1316A恒溫箱、G1314A紫外檢測器、Agilent Chemstation 色譜工作站)；中文液晶臺式超聲波清洗器(昆山美美超聲儀器有限公司)；ME204E型電子分析天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；TCS-100型電子臺秤(上海乾峰電子儀器有限公司)；PW135型中草藥粉碎機(天津泰斯特儀器有限公司)；SHH.W21電子三用水箱(北京中興偉業儀器有限公司)；QY-1中藥切片機(溫州頂歷醫療器械有限公司)；HWS-80B型恒溫恒濕培養箱(天津市意博高科實驗儀器廠)；101-0AB型電熱鼓風干燥箱(北京中興偉業儀器有限公司)；LC-E096P灶頭(電陶爐，廣東順德忠臣電器有限公司)。

1.2 藥材及試劑

23批防風藥材經本校藥植鑒定教研室王智副教授鑒定為傘形科植物防風Saposhnikoviadivaricata(Turcz.)Schischk.的干燥根；防風飲片(由本實驗室自制)；升麻素苷對照品(批號：111522-201712)，購自中國食品藥品檢定研究院(國家藥品標準物質)，供含量測定用(升麻素苷含量96.2%)；5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品(批號：111523-201610)，購自中國食品藥品檢定研究院(國家藥品標準物質)，供含量測定用(5-O-甲基維斯阿米醇苷含量96.1%)；甲醇為色譜純，水為重蒸餾水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；洗脫方式：線性梯度，0～70 min(20%甲醇～90%甲醇)，檢測波長為254 nm，流速：1.0 mL·min-1，進樣量：10μL，柱溫：30 ℃，理論板數按升麻素苷峰計算，應不低于2 000。

2.2 基本分析方法

按照高效液相色譜法(通則0512)的相關要求進行測定，具體操作如下。

(1)升麻素苷對照品溶液的制備：取升麻素苷對照品約0.010 0 g，精密稱定，置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制成每1 mL含升麻素苷1.08 mg的升麻素苷濃溶液1；精密移取1mL升麻素苷濃溶液1于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制成每1 mL含升麻素苷0.108 mg的升麻素苷濃溶液2；精密移取6 mL升麻素苷濃溶液2于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制成每1 mL含升麻素苷64.8 μg的對照品溶液，過0.22 μm微孔濾膜至進樣小瓶中。

(2)5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品溶液的制備：取5-O-甲基維斯阿米醇苷約0.010 0 g，精密稱定，置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制成每1 mL含5-O-甲基維斯阿米醇苷1.02 mg的5-O-甲基維斯阿米醇苷濃溶液1；精密移取1 mL 5-O-甲基維斯阿米醇苷濃溶液1于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制成每1 mL含5-O-甲基維斯阿米醇苷0.102 mg的5-O-甲基維斯阿米醇苷濃溶液2；精密移取6 mL 5-O-甲基維斯阿米醇苷濃溶液2于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制成每1 mL含5-O-甲基維斯阿米醇苷61.2 μg的對照品溶液，過0.22 μm微孔濾膜至進樣小瓶中，即得。

(3)供試品溶液的制備：取過五號篩(80目)的防風藥材細粉，約0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇10 mL，稱定質量，水浴回流2 h，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，取4 mL離心5 min，吸取上清液，過0.22 μm微孔濾膜至進樣小瓶中，即得。

(4)陰性對照供試品溶液的制備：取缺防風藥材和防飲片樣品的流動相溶劑，按“2.2”項下(3)的方法同法制備，即得陰性供試品溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 取同一供試品溶液，連續進樣6次，檢測指紋圖譜峰，各共有峰相對保留時間和峰面積的比值大體一致，RSD=2.784%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復性試驗 取同一批樣品6份，按“2.2”項下方法制備成供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件分別進樣，測定其HPLC圖譜，各共有峰相對保留時間和峰面積的比值大體一致，RSD=2.869%，表明分析方法的重復性良好。

2.3.3 穩定性試驗 取同一供試品溶液，分別于0、4、8、12、24、48 h進樣，測定其HPLC圖譜，各共有峰相對保留時間和峰面積的比值基本一致，RSD=2.131%，表明供試液在48h內穩定。

2.4 指紋圖譜色譜峰的標定

取升麻素苷對照品約0.010 0 g，精密稱定，置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制成每1 mL含升麻素苷1.08 mg的升麻素苷濃溶液1；精密移取1 mL升麻素苷濃溶液1于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制成每1 mL含升麻素苷0.108 mg的升麻素苷濃溶液2；精密移取6 mL升麻素苷濃溶液2于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制成每1 mL含升麻素苷64.8 μg的對照品溶液，過0.22 μm微孔濾膜至進樣小瓶中；取5-O-甲基維斯阿米醇苷約0.010 0 g，精密稱定，置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制成每1 mL含5-O-甲基維斯阿米醇苷1.02 mg的5-O-甲基維斯阿米醇苷濃溶液1；精密移取1 mL 5-O-甲基維斯阿米醇苷濃溶液1于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制成每1 mL含5-O-甲基維斯阿米醇苷0.102 mg的5-O-甲基維斯阿米醇苷濃溶液2；精密移取6 mL 5-O-甲基維斯阿米醇苷濃溶液2于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制成每1 mL含5-O-甲基維斯阿米醇苷61.2 μg的對照品溶液，過0.22 μm微孔濾膜至進樣小瓶中，進行高效液相色譜分析[6]。通過比較對照品圖譜與樣品圖譜，對樣品圖譜中的色譜峰進行標定，樣品圖中保留時間為11.8 min處的色譜峰為升麻素苷對照品的色譜峰，保留時間為19.68 min處的色譜峰為5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品的色譜峰。見圖1至圖7。

圖1 陰性對照品指紋圖譜(甲醇空白)

圖2 升麻素苷對照品指紋圖譜

圖3 5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品指紋圖譜

圖4 防風藥材供試品指紋圖譜

圖6 23批防風藥材供試品指紋圖譜

圖7 23批防風飲片供試品指紋圖譜

2.5 防風藥材和飲片的HPLC指紋圖譜及技術參數(相似度計算)

采用國家藥典委員會推薦的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2012版》，對23批防風原藥材和防風飲片的指紋圖譜進行分析，設定時間窗寬度、多點校正、譜峰匹配，生成的對照圖譜見圖3、圖4。由圖3、圖4可知，每批防風藥材和防飲片皆含有15個共有色譜峰，其中3號峰面積較大且較穩定，因此選擇3號峰作為參照峰(保留時間為11.8 min是升麻素苷；5號峰保留時間為19.68 min是5-O-甲基維斯阿米醇苷)。對23批防風藥材和防風飲片各樣品指紋圖譜與生成的對照圖譜的相似度進行計算，結果見表1。

表1 防風藥材和飲片的指紋圖譜相似度分析結果

2.6 防風藥材和飲片指紋圖譜特征分析與比較

對23批防風原藥材和防風飲片指紋圖譜相似度進行配對t檢驗，得配對樣本相關系數γ=0.937 4，其均值差異檢驗t=0.684 1，df=22，P=0.501 1，結果表明防風原藥材和防風飲片指紋圖譜大體一致，防風炮制前后其化學成分變化無統計學差異(P>0.05)。

3 討論

本研究建立了可同時分析防風藥材及飲片的指紋圖譜分析方法，發現防風藥材與防風飲片指紋圖譜相似度差異不大，說明指紋圖譜中成分大多屬于熱穩定性成分，可同時作為防風藥材與防風飲片的質量標準項目。

通過對防風藥材及飲片指紋圖譜供試品制備方法進行研究，發現超聲法提取供試品相似度均值為0.739左右，與回流法提取供試品差異較大，故供試品制備參考《中國藥典》2020版“防風含量測定”項下供試品制備方法，采用回流法提取供試品。

本研究成果已經通過了防風藥材150 kg炮制飲片放大試驗的驗證，防風藥材與放大試驗炮制飲片相似度均大于0.9，說明本研究成果可作為防風飲片工業化生產環節中的質量控制標準之一。