抗阻運動對大鼠血清vWF含量及導管相關性血栓形成的實驗研究

黃欣欣，應燕萍，蔣慶娟，韋佳妮，文 萃，趙慧函

廣西醫科大學第一附屬醫院，廣西530021

1929年，德國外科醫生Werner Forssman完成了世界上首例中心靜脈置管術，開啟了中心靜脈導管(central venous catheter， CVC)的時代[1]。CVC是指經頸內靜脈、鎖骨下靜脈或股靜脈置入且尖端位于上、下腔靜脈或右心房附近的細長、柔軟中空導管[2]。每年都有上千萬的CVC在全球醫療機構被應用于各類急危重癥病人的支持與治療[1]。盡管CVC優點眾多，但也有著不可忽視的并發癥，其中，導管相關性血栓(catheter related thrombosis，CRT)是其最常見的嚴重并發癥之一。CRT被定義為CVC所在靜脈處發展形成的血栓[3]，可導致深靜脈血栓、肺栓塞以及血栓后綜合征的發生，嚴重影響病人的生活質量，因此，有效預防CRT的形成至關重要。CRT主要與穿刺時或留置導管過程中刺激損傷血管內皮、血流動力學改變以及病人自身狀態等因素有關[4]。血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)是一種由內皮細胞和巨核細胞合成分泌的多聚體糖蛋白且其分泌受血流動力學的調控，在內皮細胞損傷或受刺激時被大量釋放至血液循環參與生理止血和血栓形成過程，被認為是有價值的內皮損傷與血栓形成標志物[5-6]。

美國靜脈輸液護理學會鼓勵病人進行置管側肢體的早期規律運動與鍛煉以有效預防CRT形成，而非使用藥物策略[7]。適度的物理運動被認為是一種有益的生理刺激，其通過增加局部血流量，加快血流速度，促進血管舒張等修復血管內皮損傷，保持內皮功能穩態以最小化血管并發癥[8]。抗阻運動是指通過使肌肉收縮來對抗外部阻力，以達到肌肉質量增長，力量和骨密度增加的任何形式的運動，具有低能耗的特點[9]。臨床研究證實，抗阻運動如握拳活動、握力器鍛煉、抓握握力球等均能有效預防CRT的發生[10]。但目前關于抗阻運動預防CRT發生的分子機制的研究仍較少，本研究旨在通過構建CVC大鼠模型，進行4周抗阻運動干預后觀察血栓形成情況，并測定血清vWF的含量，探討抗阻運動預防CRT形成的效果。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級雄性SD大鼠60只，7～8周齡，體質量230～250 g，來源于廣西醫科大學實驗動物中心(SCXK桂2020-0003)，由廣西醫科大學實驗動物中心SPF級動物房代養(SYXK桂2020-0004)。環境溫度控制在20～25 ℃，空氣濕度為60%～70%，12 h光/暗循環，自由進食與飲水。實驗所有過程遵循3R原則，且已獲廣西醫科大學實驗動物福利與倫理委員會審批。

1.2 主要儀器及試劑

硅膠導管與堵頭(2#PU，北京思科諾斯生物科技有限公司)，實驗動物爬梯(課題組自主研發，專利號：CN201921509747.4)，大鼠vWF酶聯免疫吸附法(ELISA)試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司，批號：ml1003160-C)，10%中性甲醛(G2161，北京索萊寶科技有限公司)，伊紅-蘇木精染色(HE)染色試劑盒(G1120，北京索萊寶科技有限公司)，中性樹脂(G8590，北京索萊寶科技有限公司)，恒溫孵育箱(IGS180，美國Thermo Scientific公司)，酶標儀(SynergyH1，美國Bio Ted儀器有限公司)，數字切片掃描與應用系統(Nano Zoomer s60，日本濱松光子學株式會社)，石蠟包埋機(Histo Core Arcadia H，德國LEICA公司)，切片機(Histo Core BIOCUT，德國LEICA公司)。

1.3 實驗動物分組

全部大鼠均進行7 d的無負重適應性爬梯訓練，完成預爬的大鼠被納入實驗，否則予以剔除。按照隨機分組原則，將大鼠分到空白組、假手術組、置管術組、置管術+抗阻運動組，每組15只。空白組大鼠不予任何處理，正常飼養；假手術組行假手術后，正常飼養；置管術組行置管術，正常飼養；置管術+抗阻運動組行中心靜脈置管術后第1天進行抗阻運動干預。

1.4 實驗方法

1.4.1 置管方法

基于課題組前期研究[11]并借鑒宋文煜等[12]小鼠頸靜脈置管經驗進行造模。3%戊巴比妥鈉(1.5 mL/kg)[13]經腹腔注射給藥麻醉大鼠至理想狀態，取仰臥位，固定后行備皮、消毒和鋪巾，頸前正中線右外0.5 cm處做一長約1 cm縱向切口，鈍性分離皮下組織與肌肉，充分暴露與游離出右頸外靜脈。在近心端和遠心端血管下方分別放置4-0縫線，在靜脈上做“V”型切口并置入導管，回抽見回血后推注生理鹽水，堵頭封閉導管末端，縫線固定導管后進行逐層縫合，消毒傷口并清除周圍血跡。取暖器保溫，促使大鼠復蘇，觀察至清醒后放回鼠籠。

1.4.2 假手術方法

假手術即置入導管至理想位置后拔出，不予留置導管于大鼠體內，壓迫止血后逐層縫合，取暖器保溫、促使大鼠復蘇，觀察至清醒后放回鼠籠。

1.4.3 抗阻運動方案

參照大鼠抗阻運動模型[14]適當修改干預方案，置管術后第1天利用實驗動物爬梯[15]進行抗阻運動干預。采用大鼠尾部砝碼負重的方式，第1周負重量為體質量的10%，第2周、第3周、第4周分別負重體質量的30%、50%和70%，頻次為4次/組，間隔每次1 min，每天2組，每周5 d，共4周。大鼠從爬梯底部爬至頂部，必要時可通過刺激鼠尾誘導其進行爬梯運動，具體干預方案見表1。

表1 抗阻運動干預方案

1.4.4 標本采集

末次抗阻運動結束當天完成所有大鼠取材工作，3%戊巴比妥鈉(1.5 mL/kg)麻醉后解剖大鼠，經腹主動脈采血3 mL，室溫放置2 h后在4 ℃，1 000 r/min條件下離心10 min，取上清，保存于-80 ℃冰箱待測。取下導管所在靜脈組織段浸泡于10%甲醛固定液中。

1.5 指標評估

1.5.1 血栓形成情況

取下的血管組織于10%甲醛固定48 h，經程序性脫水、石蠟包埋、組織切片、HE染色和中性樹脂封片等步驟后，掃片儀40×倍鏡下掃片，觀察血栓形成情況，Image-Pro Plus 6.0軟件計算血栓面積百分比(血栓面積百分比=血栓面積 /血管腔橫截面積 ×100)。

1.5.2 血清vWF含量測定

使用ELISA試劑盒檢測大鼠血清vWF含量，所有步驟均根據試劑盒說明書嚴格執行。酶標儀建立標準曲線并檢測450 nm處吸光度值，計算vWF含量。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 基本情況

所有大鼠置管均為一次成功，成功率為100%；導管留置期間大鼠未出現出血、感染以及死亡等情況，存活率為100%。干預前各組大鼠體質量均衡可比，差異無統計學意義(P>0.05)。抗阻運動干預第1周至第3周，各組大鼠體質量比較差異無統計學意義(P>0.05)，第4周干預結束時，置管術+抗阻運動組大鼠體質量較置管術組更輕，差異有統計學意義(P<0.001)，詳見表2。

表2 各組大鼠體質量變化情況比較 單位：g

2.2 血栓形成情況

大鼠血栓形成情況見表3，HE染色結果見圖1。

圖1 光鏡下血栓形態圖(HE染色，40×倍鏡，500 μm)(A為空白組；B為假手術組；C為置管術組；D為置管術+抗阻運動組)

2.3 大鼠血清vWF含量(見表4)

表4 各組大鼠血清vWF含量比較 單位：ng/mL

3 討論

根據魏爾嘯提出的血栓形成“三要素”理論[16]可知，血管內皮損傷、血液緩滯以及血液高凝狀態是導致血栓發生的主要病因，也是促使CRT高發的原因。在不同研究中CRT發生率不盡相同，這可能與研究方法、研究對象和診斷方法等不同有關。有研究統計，癥狀性血栓發生率為6.7%[17]，而無癥狀性CRT占比高至68.0%[18]，由此可見CRT具有高發而隱匿的特點。CRT的主要預防策略包括藥物和物理干預，但現有指南與文獻不建議藥物抗凝作為CRT的一級預防策略。而運動可以通過加快血流速度、介導血管舒張、調控血液中凝血活性物質以及改變血液流變學，如提高血流對靜脈管壁的剪切應力從而預防血栓事件的發生[19]。相比而言，物理運動具有不增加病人出血風險、安全、經濟、易于推廣等優點。

在本研究中，空白組大鼠無血栓形成，假手術組和置管術組大鼠CRT發生率分別為33.33%和80.00%，置管術+抗阻運動組大鼠經過4周抗阻運動干預后CRT發生率為13.33%，置管術+抗阻運動組與置管術組相比，差異有統計學意義(P<0.001)；而置管術+抗阻運動組與空白組比較，CRT發生率差異無統計學意義(P>0.05)。此外，對各組大鼠的平均血栓面積比較也得到了同樣的趨勢，置管術+抗阻運動組大鼠的平均血栓面積為4.79%，低于置管術組。因此，本研究結果證實了抗阻運動有利于預防和減少CRT的發生。導管置入過程必然伴隨著血管內皮的損傷，CRT是血管壁創傷后不可避免的事件[20]。雖然導管置入會導致血管內皮損傷，但通過假手術組(CRT發生率33.33%)和置管術組(CRT發生率80.00%)的比較可知，假手術組大鼠血栓形成明顯少于置管術組(P<0.05)。提示，靜脈穿刺雖然會引起血管內皮的損傷，但長期留置導管對血管壁產生的刺激才是引起內皮損傷的主要原因。同時，導管的存在占據了一定的血管腔體積導致血流減緩，有研究顯示，導管直徑與血管直徑比值越小即導管占據血管腔體積越大，血液淤滯越嚴重，越有利于CRT形成[21]。

完整的血管內皮對于血管功能穩態的維持至關重要，是發揮抗血栓、調節血管張力以及免疫調節等功能的前提。vWF與血管內皮損傷和血栓的形成有關，被認為是有價值的判斷血管內皮損傷程度和血栓風險標志物，由內皮細胞與巨核細胞合成并被儲存于內皮細胞中的韋伯小體和血小板中。vWF通過誘導血小板黏附、聚集至內皮損傷處，并激活血小板啟動凝血級聯；作為載體與Ⅷ因子結合，延長其半衰周期；促使纖維蛋白原生成這3條途徑共同促使血栓形成[22]。臨床研究發現，vWF在深靜脈血栓形成病人和健康人中差異性表達，深靜脈血栓病人vWF血漿濃度高于健康人(P<0.05)[23]，腦梗死病人血清vWF水平也較健康人更高[24]。CVC穿刺過程中血管內皮局部損傷，凝血和炎癥反應級聯被激活，而運動能降低內皮氧化應激損傷和減少促炎性因子的表達，從而促使血管內皮損傷修復[25]，減少血栓的形成。本研究結果顯示，與空白組相比，假手術組和置管術組大鼠血清vWF含量增加(P<0.05)；經過運動干預后，置管術+抗阻運動組大鼠血清vWF含量低于置管術組[(423.48±99.99)ng/mL與(205.71±83.77)ng/mL，P<0.001]，與空白組比較差異無統計學意義(P>0.05)。進一步證實血管內皮損傷會導致vWF釋放增多，促使CRT的形成，也證實了抗阻運動能夠促使血管內皮損傷修復，減少vWF分泌，從而達到預防CRT形成的目的。

4 小結

抗阻運動能有效預防導管相關性血栓的發生，可降低導管相關性血栓的發生率和平均血栓面積百分比，其機制可能是減輕與修復內皮損傷、減少內皮細胞釋放vWF，從而減少血小板的黏附與聚集，最終預防血栓的形成。