桃紅四物湯治療腰椎間盤突出癥的網絡藥理學機制

許盧春 王建軍 李華南

摘要 目的：探討桃紅四物湯治療腰椎間盤突出癥的作用機制。方法：借助中藥整合藥理學平臺，結合中醫藥大數據，按照“中藥-成分-靶標-通路”關聯性研究，探討其治療腰椎間盤突出的作用機制。結果：共得到桃紅四物湯有效成分69個和腰椎間盤突出癥的相關靶點396個，進行映射得到48個共同靶點。進行蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡及其拓撲分析后得到含有203個節點的PPI網絡，可能是桃紅四物湯治療LDH的重要靶點。進行基因本體（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析得到各排名前20的生物過程、分子功能、細胞組分和KEGG信號通路，生物過程涉及對脂多糖的反應、對細菌起源分子的反應等;分子功能涉及絲氨酸水解酶活性、細胞因子受體結合等;細胞組分涉及膜筏、膜微區等;KEGG信號通路涉及AGE-RAGE、TNF、IL-17等。結論：桃紅四物湯通過多種通路對腰椎間盤突出癥產生治療作用，生物學機制可能與AGE-RAGE、TNF、IL-17等有關。

關鍵詞 網絡藥理學;桃紅四物湯;中藥;腰椎間盤突出癥;靶點;基因;信號通路;作用機制

Abstract Objective：To explore the mechanism of Taohong Siwu Decoction in the treatment of lumbar intervertebral disc herniation.Methods：With the aid of the integrated pharmacology platform of Chinese medicinals，combined with the big data of traditional Chinese medicine，according to the correlation study of “Traditional Chinese Medicine-Ingredients-Target-Pathway”，the mechanism of its treatment of lumbar disc herniation was discussed.Results：A total of 69 effective components of Taohong Siwu Decoction and 396 related targets of lumbar disc herniation were obtained，and 48 common targets were obtained by mapping.After analyzing the protein interaction network and its topology，a protein interaction network with 203 nodes was obtained，which may be an important target of Taohong Siwu Decoction in the treatment of LDH.After the GO and KEGG pathway enrichment analysis，the top 20 biological processes，molecular functions，cell composition and KEGG signaling pathways are obtained.The biological process involved the reaction to lipopolysaccharide and the reaction to the molecules of bacterial origin; molecular functions involve serine hydrolase activity，cytokine receptor binding，etc.; cell composition involves membrane rafts，membrane microdomains，etc.; KEGG signaling pathway involves AGE-RAGE，TNF，IL-17 etc.Conclusion：Taohong Siwu Decoction has a therapeutic effect on lumbar intervertebral disc herniation through a variety of pathways.The biological mechanism may be related to AGE-RAGE，TNF，IL-17，etc.

Keywords Network pharmacology; Taohong Siwu Decoction; Traditional Chinese medicine; Lumbar disc herniation; Targets; Genes; Signaling pathway; Mechanism

中圖分類號：R285文獻標識碼：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.01.007

腰椎間盤突出癥（Lumbar Disc Herniation，LDH）是腰腿痛最常見原因之一，也是常見的缺勤、就診、住院和手術原因[1]。文獻報道該病國內發病率為18%，青少年的發病率為1%～5%，但如今LDH發病率開始逐年穩固上升且越趨于年輕化[2-4]。手術治療LDH具有創傷且可能會產生一系列的并發癥，患者往往不易于接受。保守療法創傷小，患者普遍易于接受，是目前臨床上LDH的首選治療方法，80%～90%的LDH患者的病情可隨保守治療時間延長有所改善甚至痊愈[5-6]。西醫治療LDH以抗炎鎮痛、促進淋巴回流、營養神經等藥物，牽引和理療為主。中醫治療以中藥內服、外用，針灸，推拿等方法為主，治療效果明顯且不良反應少，是大多數LDH患者選擇的治療方式之一[7]。

LDH在中醫學中屬于“骨錯縫”“筋出槽”“腰痛”“腰痹”等疾病范疇，多由于外傷、勞損而致經絡受損從而導致氣滯血瘀、經絡受阻，因此一般使用理氣通絡、活血化瘀的治法進行治療[8-10]。桃紅四物湯始于清代《醫宗金鑒》，以活血養血為主要功效，桃仁、紅花使瘀血祛，熟地黃、當歸、芍藥使新血生，川芎使氣機暢，全方以活血化瘀為核心，療效確切，但是治療機制尚不明確[11-14]。本研究借助網絡藥理學進行分析，為本病的臨床和基礎研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 桃紅四物湯活性成分的挖掘與篩選

在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）數據庫中對桃紅四物湯中的桃仁、紅花、熟地黃、白芍、當歸、川芎6味中藥逐一進行檢索，納入口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%并且類藥性（Drug Likeness，DL）≥0.18的活性成分。

1.2 LDH靶點的挖掘

檢索疾病以找到相關靶點，檢索數據庫為GeneCards，檢索詞為“Lumbar Disc Herniation”。將在數據庫中查找到的數據信息進行相應的錄入和整理。

1.3 核心靶點篩選及活性成分-靶點網絡的構建

利用Venny 2.1在線工具繪制桃紅四物湯有效活性成分和LDH靶點的韋恩圖，得到桃紅四物湯治療LDH的核心靶點。使用Cytoscape 3.8.2構建活性成分-靶點網絡圖。

1.4 蛋白質-蛋白質相互作用網絡構建

將交集靶點上傳至Cytoscape 3.8.2軟件，運用BisoGenet數據包進行蛋白質-蛋白質相互作用（Protein-protein Interaction，PPI）網絡的構建。再通過限定計算度中心度（DC）和中間度中心度（BC），篩選PPI網絡中具有拓撲重要性的相關節點，最后得到核心網絡。

1.5 基因本體與京都基因與基因組百科全書分析

使用R 3.6.1進行基因本體（Gene Ontology，GO）與京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。并借助Cytoscape 3.8.2軟件構建網絡圖以說明靶點及信號通路所發揮的作用。

2 結果

2.1 桃紅四物湯活性成分及靶點

對桃紅四物湯中的所有中藥成分進行篩選，篩選條件為OB≥30%和DL≥0.18，共得到桃紅四物湯的69個有效成分。見表1～6。桃仁、紅花、熟地黃、白芍、當歸、川芎的成分分別為23、22、2、13、2、7個。

2.2 核心靶點篩選及活性成分-靶點網絡的構建

在GeneCards數據庫對LDH進行檢索后找到相關靶點共396個，與桃紅四物湯取交集后，共得48個共同靶點。見圖1，表7。Cytoscape構圖得到了一個包含79個點和136條邊的活性成分-靶點網絡。其中桃仁、紅花、白芍和川芎的活性成分分別為藍色、粉色、綠色和黃色，藥物共有的活性成分為紅色，交集靶點為藍色。前列腺素內過氧化物合酶2（PTGS2）、雄激素受體（AR）、半胱天冬蛋白酶3（CASP3），轉錄因子AP-1（JUN）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）為Degree值排名前5的靶點，它們的值分別是30、7、6、5、5。見圖2。

2.3 PPI網絡構建分析

將交集靶點上傳至Cytoscape 3.8.2軟件，運用BisoGenet數據包進行PPI網絡的構建，限定研究物種為人類，進行PPI分析得到網絡圖，此網絡包含了3 359個節點。見圖3A。通過設置計算度中心度（DC）≥61后創建子網絡，此網絡包含了753個節點。見圖3B。中間度中心度（BC）≥600子網絡，含有203個節點，可能是桃紅四物湯治療LDH的重要靶點。見圖3C。

2.4 GO功能富集分析

使用R 3.6.1進行GO富集分析。得出排名靠前的20個生物過程（Biological Process，BP）、分子功能（Molecular Function，MF）及細胞組分（Cell Component，CC），BP涉及對脂多糖的反應、對活性氧的反應、對氧化應激的反應及對營養水平的反應等;MF涉及絲氨酸水解酶活性、細胞因子受體結合及細胞因子活性等;CC涉及膜筏、囊泡腔、膜區及膠原蛋白細胞外基質等。見圖4～6。柱狀圖的長度和紅色的程度代表了富集基因的數目和富集的顯著程度。

2.5 KEGG信號通路富集分析

使用R 3.6.1軟件和Cytoscape 3.8.2軟件進行KEGG通路富集分析和治療靶點信號通路網絡圖的構建。見圖7。KEGG分析得出靶點主要富集于AGE-RAGE通路、TNF通路、IL-17通路、松弛素通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、卡波西氏肉瘤相關皰疹病毒感染等。見圖8。泡泡節點的大小和紅色的程度代表了富集基因的數目和富集的顯著程度。

3 討論

LDH最常見的證型為氣滯血瘀型，一般使用理氣通絡、活血化瘀的治法進行治療，治療后氣血調達、痹阻通暢，故可使臨床癥狀有所好轉[11，15-16]。經典活血化瘀名方桃紅四物湯具有活血養血，祛瘀行滯的作用，更適用于治療氣滯血瘀型的LDH，且在降低LDH術后復發率、抗炎鎮痛方面具有作用[17-21]。

網絡藥理學是探索藥物與疾病之間關系的一種方法，通過“疾病-基因-靶點-藥物”相互作用網絡將其呈現出來[22]。本研究利用網絡藥理學這一工具預測桃紅四物湯治療LDH的可能機制。LDH的癥狀主要由于各種原因導致髓核組織突出纖維環壓迫脊髓、神經根而來，但也還與炎癥介質以及介導的反應相關。髓核突出后引起血管擴張以及通透性增加，伴隨著增加的炎癥介質誘發各種信號轉導[23-25]。同時椎間盤退變也與髓核含水量、降解的細胞外基質等多個生物學因素相關。所以桃紅四物湯對于LDH的治療機制可能體現在對炎癥的抑制，細胞凋亡的調控，減緩椎間盤的蛻變速度，保護壓迫的神經等方面[26-28]。

本研究借助TCMSP，共得到桃紅四物湯的69個活性成分，其中桃仁的活性成分最多，其次為紅花，說明了桃仁、紅花在本方中的重要作用。在GeneCards數據庫對LDH進行檢索后找到相關靶點共396個，與桃紅四物湯取交集后，共得到48個共同靶點。Cytoscape構圖得到了一個包含79個點和136條邊的活性成分-靶點網絡，顯示桃紅四物湯治療LDH的多靶點特性，PTGS2、AR、CASP3、JUN、AKT1為Degree值排名前5的靶點，提示本方的作用機制涉及炎癥反應、激素調控、細胞凋亡等。

PPI網絡說明靶點之間的相互作用調節可能是桃紅四物湯治療LDH的潛在機制之一。從GO功能富集分析可知，桃紅四物湯治療LDH主要涉及對脂多糖的反應、對活性氧的反應、對氧化應激的反應及對營養水平的反應等生物過程。

KEGG富集分析發現桃紅四物湯對于LDH的治療機制可能與AGE-RAGE、TNF、IL-17信號通路等相關。AGE-RAGE信號通路對下游通路的激活會導致細胞功能紊亂，同時活化IL-6、核因子κB信號通路、半胱天冬蛋白酶3、基質金屬蛋白酶等的表達，促進炎癥介質的表達導致炎癥反應[29-31]。TNF信號通路同樣與炎癥介質相關，腫瘤壞死因子可以對其他通路產生激活效應而誘發炎癥級聯反應，導致疼痛的發生及加劇[32]。IL-17可作用于人內皮細胞、巨噬細胞、軟骨細胞及骨細胞等多種細胞，并可誘導其他炎癥介質如TNF-α、IL-1β、IL-6、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）等的表達，從而發揮其致炎作用[33-36]。因此，桃紅四物湯治療LDH的有效性來源可能與對炎癥介質及細胞凋亡的控制相關。

桃紅四物湯治療LDH具有多靶點、多途徑、多通路等特點，其主要生物學機制可能與AGE-RAGE、TNF、IL-17信號通路等有關。本研究初步闡述了桃紅四物湯治療LDH的潛在靶點和信號通路，為以后臨床實踐提供參考。但由于靶標眾多等因素的干擾以及網絡藥理學的自身局限性[37]，研究結果的偏差需要進一步的分子生物學和生物信息學來進行驗證。

參考文獻

[1]Zhu L，Huang Y，Hu Y，et al.Toll-like receptor 4/nuclear factor-kappa B pathway is involved in radicular pain by encouraging spinal microglia activation and inflammatory response in a rat model of lumbar disc herniation[J].Korean J Pain，2021，34（1）：47-57.

[2]孫凱，朱立國，魏戌，等.基于網絡藥理學的“淫羊藿-白芍”配伍治療腰椎間盤突出癥作用機制研究[J].中國中藥雜志，2020，45（3）：609-616.

[3]Paulsen RT，Rasmussen J，Carreon LY，et al.Return to work after surgery for lumbar disc herniation，secondary analyses from a randomized controlled trial comparing supervised rehabilitation versus home exercises[J].Spine J，2020，20（1）：41-47.

[4]余曉艷，史勝苗，劉芳琴.青少年腰椎椎間盤突出癥流行病學及危險因素分析[J].湖南師范大學學報：醫學版，2018，15（5）：101-104.

[5]Selva-Sevilla C，Ferrara P，Gerónimo-Pardo M.Cost-utility Analysis for Recurrent Lumbar Disc Herniation：Conservative Treatment Versus Discectomy Versus Discectomy With Fusion[J].Clin Spine Surg，2019，32（5）：E228-228E234.

[6]Hirayama K，Tsushima E，Arihara H，et al.Developing a clinical prediction rule to identify patients with lumbar disc herniation who demonstrate short-term improvement with mechanical lumbar traction[J].Phys Ther Res，2019，22（1）：9-16.

[7]王秀艷，于希軍.中西醫治療腰椎間盤突出癥研究進展[J].現代中西醫結合雜志，2019，28（10）：1132-1136.

[8]陳國銘，湯順莉，馮家明，等.嶺南骨科中藥治療腰椎間盤退變研究進展[J].中華中醫藥雜志，2018，33（1）：201-205.

[9]彭斯偉，宋敏，范凱，等.腰椎間盤突出癥的分期分級中醫防治策略[J].中醫正骨，2020，32（10）：64-66，70.

[10]溫澤發，牛淑芳，曾令友，等.腰痛六合散熨療聯合針刺治療血瘀型腰椎間盤突出癥[J].中國實驗方劑學雜志，2018，24（7）：217-222.

[11]劉行高，魏彬，王洪濤，等.自擬行氣化瘀健腰湯聯合推拿牽引在氣滯血瘀型腰椎間盤突出癥患者康復治療中的應用效果[J].世界中醫藥，2020，15（4）：604-608.

[12]聶欣，成顏芬，王琳，等.桃紅四物湯化學成分、藥理作用、臨床應用的研究進展及質量標志物的預測分析[J].中國實驗方劑學雜志，2020，26（4）：226-234.

[13]張楨陽，丁積勇，孟永久，等.桃紅四物湯加減對四肢骨折患者術后血清炎癥因子及血液流變學指標的影響[J].中國中醫骨傷科雜志，2020，28（11）：46-49.

[14]王升菊，劉倩倩，江華娟，等.基于網絡藥理學和分子對接技術探討桃紅四物湯治療原發性痛經的有效成分及作用機制[J].中國中藥雜志，2020，45（22）：5373-5382.

[15]國家中醫藥管理局.中醫病證診斷療效標準[S].南京：南京大學出版社，1994.

[16]陳鋒，吳曉飛，閆乾，等.腰椎間盤突出癥中醫證候學研究[J].遼寧中醫藥大學學報，2019，21（12）：13-16.

[17]龍正友，陳小強，姜國棋，等.桃紅四物湯加減配合射頻消融髓核成形術治療頸腰椎間盤突出癥的臨床觀察[J].中華中醫藥學刊，2019，37（10）：2558-2560.

[18]白子興，曹旭含，孫承頤，等.基于網絡藥理學探討桃紅四物湯延緩股骨頭壞死病變進程作用機制[J].遼寧中醫藥大學學報，2020，22（12）：65-70.

[19]康斯文，侯德才.桃紅四物湯對股骨頭壞死患者BGP、BAP水平及血液流變學影響[J].遼寧中醫藥大學學報，2021，23（3）：139-142.

[20]黃建國，陳明光.股骨近端防旋髓內釘技術內固定聯合桃紅四物湯對老年創傷性骨折臨床療效分析[J].中華中醫藥學刊，2020，38（3）：222-225.

[21]Ding X，Xu J，Wang C，et al.Suppression of the SAP18/HDAC1 complex by targeting TRIM56 and Nanog is essential for oncogenic viral FLICE-inhibitory protein-induced acetylation of p65/RelA，NF-κB activation，and promotion of cell invasion and angiogenesis[J].Cell Death Differ，2019，26（10）：1970-1986.

[22]倪勝樓，方明，趙笑芃，等.基于PubMed和Web of Science數據平臺的中醫藥網絡藥理學論文特征分析[J].遼寧中醫藥大學學報，2019，21（12）：73-77.

[23]Cunha C，Silva AJ，Pereira P，et al.The inflammatory response in the regression of lumbar disc herniation[J].Arthritis Res Ther，2018，20（1）：251.

[24]Palada V，Ahmed AS，Finn A，et al.Characterization of neuroinflammation and periphery-to-CNS inflammatory cross-talk in patients with disc herniation and degenerative disc disease[J].Brain Behav Immun，2019，75：60-71.

[25]Hasvik E，Schjlberg T，Jacobsen DP，et al.Up-regulation of circulating microRNA-17 is associated with lumbar radicular pain following disc herniation[J].Arthritis Res Ther，2019，21（1）：186.

[26]Wang YH，Li Y，Wang JN，et al.A Novel Mechanism of Specialized Proresolving Lipid Mediators Mitigating Radicular Pain：The Negative Interaction with NLRP3 Inflammasome[J].Neurochem Res，2020，45（8）：1860-1869.

[27]Xu Z，Zhou X，Chen G.Expression and Mechanism of Interleukin 1（IL-1），Interleukin 2（IL-2），Interleukin 8（IL-8），BMP，Fibroblast Growth Factor 1（FGF1），and Insulin-Like Growth Factor（IGF-1） in Lumbar Disc Herniation[J].Med Sci Monit，2019，25：984-990.

[28]Sun Z，Zhao H，Liu B，et al.AF cell derived exosomes regulate endothelial cell migration and inflammation：Implications for vascularization in intervertebral disc degeneration[J].Life Sci，2021，265：118778.

[29]Yu W，Tao M，Zhao Y，et al.4′-Methoxyresveratrol Alleviated AGE-Induced Inflammation via RAGE-Mediated NF-κB and NLRP3 Inflammasome Pathway[J].Molecules，2018，23（6）：23061447.

[30]Cardoso JV，Machado DE，da Silva MC，et al.Matrix metalloproteinases 3 polymorphism increases the risk of developing advanced endometriosis and infertility：A case-control study[J].Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol X，2019，3：100041.

[31]Subedi L，Lee JH，Gaire BP，et al.Sulforaphane Inhibits MGO-AGE-Mediated Neuroinflammation by Suppressing NF-κB，MAPK，and AGE-RAGE Signaling Pathways in Microglial Cells[J].Antioxidants（Basel），2020，9（9）：9090792.

[32]Lu CH，Ou HC，Day CH，et al.Deep sea minerals ameliorate diabetic-induced inflammation via inhibition of TNFα signaling pathways[J].Environ Toxicol，2020，35（4）：468-477.

[33]Li X，Bechara R，Zhao J，et al.IL-17 receptor-based signaling and implications for disease[J].Nat Immunol，2019，20（12）：1594-1602.

[34]Mercurio L，Failla CM，Capriotti L，et al.Interleukin（IL）-17/IL-36 axis participates to the crosstalk between endothelial cells and keratinocytes during inflammatory skin responses[J].PLoS One，2020，15（4）：e0222969.

[35]Sommerfeld SD，Cherry C，Schwab RM，et al.Interleukin-36γ-producing macrophages drive IL-17-mediated fibrosis[J].Sci Immunol，2019，4（40）：4783.

[36]Frieder J，Kivelevitch D，Haugh I，et al.Anti-IL-23 and Anti-IL-17 Biologic Agents for the Treatment of Immune-Mediated Inflammatory Conditions[J].Clin Pharmacol Ther，2018，103（1）：88-101.

[37]世界中醫藥學會聯合會.網絡藥理學評價方法指南[J].世界中醫藥，2021，16（4）：527-532.

（2021-01-03收稿 本文編輯：魏慶雙）