補腎益肺消癥方對肺纖維化上皮間質轉化中瘦素相關因子的影響

金譯涵 張迪 賀晉芳 鄭佳昆 李金桐 張亞楠 宋潔 晏軍

摘要 目的：明確肺纖維化上皮-間質轉化（EMT）對瘦素相關因子的影響，對瘦素加速EMT的分子機制進行初探，并觀察補腎益肺消癥方對EMT過程中瘦素相關因子的作用。方法：將A549細胞根據干預手段不同分為正常組、模型組[轉化生長因子-β1（TGF-β1）]、中藥組（TGF-β1+補腎益肺消癥方）、尼達尼布組（TGF-β1+尼達尼布），免疫熒光觀察α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、E-鈣黏附蛋白（E-cadherin）的表達，酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測細胞上清中的瘦素水平，Western Blotting檢測瘦素受體（LEPR）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPAR-γ）的蛋白含量以及STAT3的活化程度。結果：與正常組比較，模型組細胞上清中瘦素水平升高（P<0.01），中藥組、尼達尼布組出現不同程度的下降（P<0.001）;與正常組比較，模型組LEPR蛋白表達升高（P<0.001），PPAR-γ表達下降（P<0.05），STAT3活化水平降低，中藥組、尼達尼布組LEPR蛋白表達下調（P<0.001），PPAR-γ表達上調（P<0.05），中藥組STAT3活化程度與模型組比較差異無統計學意義（P>0.05），尼達尼布組與模型組比較，STAT3活化水平升高（P<0.01）。結論：EMT可促進細胞內源性肺瘦素的分泌，增加細胞表面LEPR的表達，下調與瘦素有拮抗作用的PPAR-γ的含量，減少STAT3的活化，為瘦素加速EMT進程提供物質基礎。而補腎益肺消癥方則可能通過降低內源性肺瘦素分泌，減少LEPR，提高PPAR-γ的水平逆轉此過程。

關鍵詞 補腎益肺消癥方;肺纖維化;上皮間質轉化;瘦素;A549細胞;瘦素受體;過氧化物酶體增殖物激活受體γ;轉化生長因子-β1

Abstract Objective：To clarify the effect of epithelial mesenchymal transition（EMT） on leptin-related factors in pulmonary fibrosis，explore the molecular mechanism of leptin accelerating EMT，and observe the effects of Bushen Yifei Xiaozheng Formula on leptin-related factors in the process of EMT.Methods：A549 cells were divided into a control group，a model group（TGF-β1），a Chinese medicinal group（TGF-β1+Bushen Yifei Xiaozheng Formula），and Nintedanib group（TGF-β1+Nintedanib） according to different intervention methods.The expressions of α-smooth muscle actin（α-SMA） and E-cadherin were observed by immunofluorescence.The leptin level in cell supernatant was detected by ELISA，and the protein content of LEPR，PPAR-γ and the activation degree of STAT3 were detected by Western blot.Results：Compared with control group，leptin level in cell supernatant of model group was increased（P<0.01），and decreased in Chinese medicine group and Nintedanib group（P<0.001）.Compared with control group，the expression of LEPR protein in model group was increased（P<0.001），the expression of PPAR-γ was decreased（P<0.05），the activation level of STAT3 was decreased，the expression of LEPR protein in Chinese medicine group and Nintedanib group was down-regulated（P<0.001），and the expression of PPAR-γ was up-regulated（P<0.05）.The activation level of STAT3 in Chinese medicinal group was not significantly different from that in model group（P>0.05），but the activation level of STAT3 in Nintedanib group was increased compared with that in model group（P<0.01）.Conclusion：This study confirmed that EMT can promote the secretion of endogenous lung leptin，increase the expression of LEPR on the cell surface，down-regulate the content of PPAR-γ，which has the antagonistic effect of leptin，and reduce the activation of STAT3，providing material basis for leptin to accelerate the process of EMT.However，Bushen Yifei Xiaozheng Formula may reverse this process by reducing endogenous leptin secretion，reducing LEPR and increasing PPAR-γ level.

Keywords Bushen Yifei Xiaozheng Formula; Pulmonary fibrosis; Epithelial mesenchymal transition; Leptin; A549 cell; LERP; PPAR-γ; TGF-β1

中圖分類號：R289.5文獻標識碼：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.01.013

肺纖維化是慢性肺部疾病的基本病理過程或是最終轉歸，由肺部損傷過度修復形成細胞外基質（Extracellular Matrix，ECM）堆積，阻礙肺泡毛細血管屏障氣血交換，并導致肺順應性下降，引發限制性通氣障礙，出現肺換氣和肺通氣功能雙重癱瘓，不可逆轉，從而對患者生命健康構成威脅[1]。

瘦素是一種由ob基因編碼，產生于脂肪組織，具有降低食欲、增加機體能耗、在固定范圍內維持脂肪量穩定的激素[2]。近年來已被證實在肝纖維化、腎纖維化中發揮重要作用。瘦素可與瘦素受體（Leptin Receptor，LEPR）結合后，激活肝星狀細胞，促進庫普弗細胞中轉化生長因子-β（Transforming Growth Factor-β，TGF-β）的合成，加速ECM沉積[3-4];在腎纖維化中，瘦素刺激腎內皮細胞增殖，上調系膜細胞表面TGF-β Ⅱ型受體，使得Ⅳ型膠原和纖維連接蛋白表達增加[5]。與此同時，瘦素因高度參與上皮-間質轉化（Epithelial Mesenchymal Transformation，EMT），是一種驅動EMT的關鍵生物分子[6]。眾所周知，肺泡Ⅱ型上皮細胞（Alveolar Type Ⅱ Cell，AT Ⅱ）EMT是肺纖維化早期的基本病理過程之一，Gui等[7]研究表明瘦素通過抑制自噬，通過PI3K/AKT/mTOR途徑加速A549細胞的EMT，促進肺纖維化的發展。而瘦素與AT Ⅱ EMT的具體關系尚未完全清楚，且以往研究多著重于瘦素加重EMT的分子機制，EMT對瘦素的分泌和瘦素相關因子表達的影響不甚明晰。本研究旨在明確EMT對瘦素相關因子的影響，對瘦素加速EMT的分子機制進行初探，并觀察補腎益肺消癥方對EMT過程中瘦素相關因子的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞

A549細胞，中國醫學科學院細胞庫提供。

1.1.2 試劑與儀器

重組人TGF-β1活性蛋白（Abcam公司，美國，貨號：ab50036）;尼達尼布（BIBF1120）（Medchem Express，美國，貨號：14002）;蛋白質常規分子量標記（10～180 kDa）（Proteintech，貨號：PL00001）;LEPR多克隆抗體（Proteintech，貨號：20966-1-AP）;PPARγ單克隆抗體（Abcam公司，美國，貨號：ab178860）;p-STAT3單克隆抗體（Abcam公司，美國，貨號：ab76315）;STAT3單克隆抗體（Abcam公司，美國，貨號：ab68153）;山羊抗小鼠IgG H&L（HRP）（Abcam公司，美國，貨號：ab6789）;山羊抗兔IgG H&L（HRP）（Abcam公司，美國，貨號：ab6721）;BCA試劑盒（Thermo公司，美國，貨號23227）;α-SMA（Abcam公司，美國，貨號：ab124964）;CD324（E-cadherin）單克隆抗體（eBioscience公司，美國，貨號：Cat.53-3249-80）;人瘦素ELISA試劑盒（FineTest公司，貨號：EH0216）。

倒置相差顯微鏡（OLYMPUS公司，日本，型號：BX60）;二氧化碳培養箱（SANYO公司，日本，型號：MCO-5M）;垂直層流潔凈工作臺（ESCO公司，新加坡，型號：ACB-6E1）;低溫高速離心機（Eppendorf公司，德國，型號：5424）（離心半徑為8.46 cm）;全自動連續光譜酶標儀（Thermo公司，美國，型號：MULTISKANMK3）;電泳儀（北京六一公司，型號：DYCZ-25D）;電轉儀（北京六一公司，型號：DYCZ-40D）;倒置熒光顯微鏡（Nikon公司，日本，型號：Eclipse Ti-SR）;全景掃描儀（3D HISTECH公司，匈牙利，型號：PannoramicMIDI）。

1.2 方法

1.2.1 中藥凍干粉的制備

將飲片（補腎益肺消癥方，內含當歸、熟地黃、陳皮、法半夏、浙貝母、水蛭、炙甘草）置于雙蒸水中，充分浸泡，納入煎藥壺中煎煮至沸騰，并持續30 min后倒出藥液，重復以上操作得到二煎。合并2次藥液過濾后上鍋濃縮。將放涼至室溫的藥液加入無菌培養皿中，平放于-20 ℃ 24 h后，轉移至-80 ℃繼續冷凍24 h。迅速從低溫冰箱中取出培養皿，置于真空冷凍干燥機中進行干燥。當水分完全蒸發后，收集凍干粉密封保存于-20 ℃備用。

1.2.2 分組及造模、給藥

收集對數生長期A549細胞，37 ℃、5%CO2培養24 h后，換成基礎培養基饑餓過夜。棄基礎培養基，不同組別加入不同藥物。正常組：基礎培養基;模型組：TGF-β1（終濃度為5 ng/mL，下同）;中藥組：TGF-β1+中藥凍干粉溶液（終濃度為200 μg/mL）;尼達尼布組：TGF-β1+尼達尼布（終濃度為3 μmol/L），作用24 h。

1.2.3 免疫熒光檢測細胞中α-SMA、E-cadherin表達情況

取出指數生長期的A549細胞，消化后將細胞懸液種在激光共聚焦培養皿中。干預后，棄上清液，磷酸鹽緩沖液（Phosphate-buffered Saline，PBS）清洗3次。取用預冷的4%多聚甲醛固定細胞30 min，PBS清洗3次。5%BSA封閉細胞1 h后，更換封閉液為E-鈣黏附蛋白（E-cadherin）一抗，室溫孵育1 h。隨后PBS清洗3次。0.1%TritonX100透膜15 min，PBS清洗3次。孵育α-平滑肌肌動蛋白（α-Smooth Muscle Actin，α-SMA）一抗，室溫孵育1 h，PBS清洗3次。加入TRITC熒光二抗避光孵育1 h。PBS清洗3次后加入DAPI染核，5 min后取出，PBS清洗，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察。利用Image J軟件測算熒光密度值。

1.2.4 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測細胞上清液中瘦素含量

樣品制備同前。收集細胞上清液，離心除去不溶性雜質和細胞碎片后備用。將標準品、樣品、對照（空白）孔分別置于預涂板上，記錄其位置。在加入標準品、樣品和對照（空白）孔之前，清洗預涂板2次。分別從0管、1管、2管、3管、4管、5管、6管及空白管中取出100 μL液體，加入標準孔中。向樣品孔中加入100 μL適當稀釋過的樣品。37 ℃孵育90 min。棄板中液體，用洗滌緩沖液清洗2次。在標準、樣品及對照（空白）孔每孔加入100 μL生物素標記抗體工作液。37 ℃孵育60 min。用洗滌緩沖液清洗孔板3次。在標準、樣品及對照（空白）孔每孔加入100 μL SABC工作液，37 ℃孵育30 min。用洗滌緩沖液清洗孔板5次。在標準、樣品及對照（空白）孔每孔加入90 μL TMB底物。37 ℃避光孵育10～20 min。然后每孔加入50 μL停止溶液。將孔板置于酶標儀中，波長設定為450 nm，測量OD值。再根據已知濃度的標準品OD值，繪制標準曲線，求出樣品濃度。

1.2.5 Western Blotting檢測細胞中LEPR、PPAR-γ、STAT3、p-STAT3表達水平

取出干預后的細胞，提取并變性蛋白樣品。配制SDS-PAGE凝膠。上樣后，于電泳液中電泳，電壓值設定為70 V，穩壓電泳30 min，直至溴酚藍提示蛋白樣品已經越過積層膠，將電壓改為110 V，繼續穩壓電泳。隨后取出凝膠，制作電轉三明治，于電轉液中穩流冰上電轉2 h，電流值設定為200 mA。TBST中漂洗后在合適的封閉液中室溫封閉1 h。隨后更換目標蛋白一抗4 ℃孵育過夜。TBST清洗3次，室溫孵育對應二抗1 h。TBST漂洗清除多余抗體，在避光的情況下，將充分浸泡過曝光液的PVDF膜置于發光儀中曝光，獲得條帶。應用Image J軟件獲得曝光后條帶上各樣品的灰度值。

1.3 統計學方法

采用SPSS 25.0統計軟件進行數據分析。計量資料均數±標準差（±s）表示，符合正態分布并通過方差齊性檢驗，則適用單因素方差分析，反之則采用非參數檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 補腎益肺消癥方對肺纖維化EMT模型α-SMA、E-cadherin表達量的影響

模型組的α-SMA含量明顯高于正常組（P<0.05），而E-cadherin則相反（P<0.05），TGF-β1干預A549細胞制作EMT模型成功。中藥組及尼達尼布組α-SMA表達量低于模型組（P<0.05），E-cadherin較之增高（P<0.05）。見表1，圖1～2。

2.2 補腎益肺消癥方對肺纖維化EMT模型細胞上清中瘦素含量的影響

模型組細胞上清液瘦素含量高于正常組，差異有統計學意義（P<0.01）。中藥組與模型組比較，細胞上清所含瘦素較低（P<0.01），尼達尼布組亦然（P<0.01）。補腎益肺消癥方可降低AT Ⅱ因EMT釋放的瘦素水平。見表2。

2.3 補腎益肺消癥方對肺纖維化EMT模型LEPR及PPAR-γ蛋白表達量、p-STAT3/STAT3比值的影響 模型組PPAR-γ表達水平明顯低于正常組（P<0.05）。而中藥組（P<0.05）、尼達尼布組（P<0.05）與模型組比較，PPAR-γ表達水平升高。見表3，圖3。

正常組LEPR蛋白相對表達量明顯低于模型組（P<0.001）。與模型組比較，中藥組、尼達尼布組LEPR蛋白含量有所降低，且差異有統計學意義（P<0.001）。見表4，圖4。

模型組p-STAT3/STAT3比值明顯低于正常組（P<0.01）。而與模型組比較，尼達尼布組p-STAT3/STAT3比值較高（P<0.01），中藥組p-STAT3/STAT3比值與模型組相當（P>0.05）。見表5，圖5。

3 討論

EMT是肺纖維化病理演變中的重要一環，是AT Ⅱ因各種原因引起的肺部損傷而出現細胞連接斷裂（E-cadherin減少），出現間質細胞表型（α-SMA增加），進一步影響下游成纖維細胞增殖，分化為肌成纖維細胞的過程[8]。研究證實瘦素可加速EMT，以促進肺纖維化的發生發展。

晏軍主任醫師依據多年臨床經驗，基于“肺絡微型癥瘕”的學說，認為肺纖維化的基本病機為肺腎兩虛，痰瘀互結為癥瘕，痹阻肺絡，治療肺纖維化應以補益肺腎為本，自擬補腎益肺消癥方，包含當歸、熟地黃、陳皮、法半夏、浙貝母、水蛭、炙甘草7藥。該方以景岳名方“金水六君煎”為底方，當歸、熟地黃為君滋陰養血，補腎培元;陳皮、半夏、浙貝母化痰止咳;水蛭、浙貝散結消癥;炙甘草培土生金，調和諸藥，以奏補腎益肺、化痰消癥之功。基礎實驗表明“補腎益肺消癥方”可通過調控炎癥[9-10]、凋亡[11-13]、自噬[14]通路以延緩肺纖維化病理學發展，從而達到治療的目的。

瘦素作為一種參與甚至可以調節先天性及適應性免疫，自身分子結構與IL-6相似的細胞因子[15]，硅沉著病大鼠肺纖維化組織中瘦素的表達明顯升高，外源瘦素的添加可以增加膠原蛋白在肺組織中的沉積，瘦素與HIF-1α正相關[16]。使用博來霉素誘導小鼠肺損傷，模型組小鼠支氣管灌洗液中瘦素含量高于db/db組（瘦素受體基因缺陷）。在體外實驗中，瘦素可上調人肺成纖維細胞通過TGF-β介導產生的幾種纖維化基因的表達，并能誘導TGF-β本身的自分泌[17]。由此可見瘦素與肺纖維化的發生發展相關。由于在肝纖維化中發現，活化的肝星狀細胞可自分泌瘦素以進一步加重肝損傷及肝纖維化[18]，而AT Ⅱ被證實是肺瘦素的來源之一，因此本研究用ELISA法檢測細胞上清液中瘦素的含量以觀察TGF-β1誘導下，A549細胞瘦素分泌情況。結果提示模型組細胞上清液瘦素明顯高于正常組，可見EMT可能促進AT Ⅱ自分泌瘦素。而中藥組、尼達尼布組低于模型組，表明補腎益肺消癥方及尼達尼布可抑制EMT中自分泌瘦素水平。LEPR是分布于細胞表面的瘦素受體，AT Ⅱ表面也存在它的蹤影，肺瘦素通過與LEPR結合方可影響細胞功能。PPAR-γ是Smad依賴性的TGF-β通路的關鍵抑制劑，功效包括抑制TGF-β表達、膠原蛋白合成、成肌纖維細胞分化和EMT[17]。瘦素與PPAR-γ則在功效上相互拮抗[19]。Western Blotting檢測模型組LEPR水平高于正常組，可知EMT可導致A549細胞表面LEPR表達增多，更多瘦素可與之結合產生效應;PPAR-γ水平下降，可見EMT抑制了PPAR-γ的功能，為肺瘦素進一步干預AT Ⅱ功能提供幫助。而補腎益肺消癥方可降低EMT模型中細胞表面LEPR的含量、提高PPAR-γ的表達，可能在一定程度上阻止肺瘦素加速EMT的進程。以往的研究證實瘦素于胞外與LERP結合，激活STAT3，發揮作用[20]，但是結果提示與正常組比較p-STAT3/STAT3比值降低，這看起來不符合常理。然而Wang等[21]發現EMT模型中，STAT3和Smad3直接相互作用，干擾其與Smad4結合，抑制TGF-β1信號通路，敲低STAT3基因可促進TGF-β1誘導的EMT標志蛋白的表達。所以有別于癌癥中針對瘦素干預腫瘤細胞EMT需要激活STAT3，TGF-β1誘導的EMT模型中STAT3反而是被抑制的。而中藥組似乎與STAT3的磷酸化無關。

以往的文獻研究證實瘦素可以促進肺纖維化EMT進程，而EMT對瘦素相關因子的影響尚未可知。本研究通過實驗證實EMT可增加細胞表面LEPR的表達，下調與瘦素有拮抗作用的PPAR-γ的含量，減少STAT3的活化，為瘦素加速EMT提供物質基礎。而補腎益肺消癥方則可能通過降低內源性肺瘦素分泌，減少LEPR，提高PPAR-γ的水平逆轉此過程。

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（2021-06-08收稿 本文編輯：張雄杰）